人胎盘来源的MSCs与壳聚糖-IGF-1C水凝胶共移植通过分泌PGE2改善TNBS诱导的结肠炎

发布时间：2020-06-10 19:54

【摘要】：实验背景及目的:间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植对于炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种非常有前景的治疗策略。然而,移植后细胞的低滞留率限制了MSCs在IBD治疗中的应用。在我们以往的实验中,通过将壳聚糖(chitosan,CS)固定在胰岛素样生长因子-1的C结构域肽(the C domain peptide of insulin-like growth factor-1,IGF-1C)上而合成的一种新型的具有生物活性的水凝胶基质,它可以通过模拟干细胞赖以生存的微环境来保持干细胞的活性。因此,我们的研究目的是探讨人胎盘间充质干细胞(human placenta-derived Mesenchymal stem cells,PMSCs)与壳聚糖-胰岛素样生长因子-1C(CS-IGF-1C)水凝胶通过局部注射的方式,共同移植到受损结肠,是否可以改善2,4,6-三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)诱导的小鼠的结肠炎,并阐明其机制。实验方法:构建稳定表达萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase,Fluc)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的PMSCs的细胞系,利用这种细胞系,通过生物发光成像技术(bioluminescence imaging,BLI)检测CS-IGF-1C水凝胶对PMSCs的生物相容性,以及体内促进PMSCs存活的效果。在TNBS灌肠诱导小鼠结肠炎后的第2天,在炎症部位的肠系膜根部局部注射PBS、CS或CS-IGF-1C水凝胶与PMSCs的混悬液以及不含PMSCs的PBS作为空白对照。经小动物活体成像技术检测PMSCs在第1、3、5、7天的存活情况和表征炎症反应程度的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的含量,收集肠组织进行组织病理学分析,并通过实时PCR(real time PCR)检测炎性因子的表达情况。通过蛋白印迹技术(western blot)和免疫荧光分析检测移植后肠组织及腹腔巨噬细胞的表型。通过酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定不同培养条件下(涂布CS或CS-IGF-1C水凝胶,或未涂布水凝胶的对照组)的PMSCs上清液中前列腺素E-2(prostaglandin,PGE2)的含量。实验结果:BLI结果表明,与游离的PMSCs或PMSCs/CS组相比,CS-IGF-1C水凝胶可显著促进PMSCs的增殖(p0.05)。此外,小动物活体成像结果证实,CS-IGF-1C水凝胶可显著促进移植后PMSCs在体内的存活(p0.05)。与此同时,CS-IGF-1C水凝胶与PMSCs共移植可显着改善小鼠结肠炎,增加体重,下调促炎因子的表达,并降低ROS的含量(p0.05),减轻肠道炎症,改善组织学特征。此外,ELISA结果显示CS-IGF-1C水凝胶能够促进PMSCs对PGE2的释放(p0.05)。从免疫荧光分析结果得出CS-IGF-1C水凝胶能够促进PMSCs对M2巨噬细胞的极化同时伴随白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)的表达,并进一步降低M1巨噬细胞的水平(p0.05)。结论:局部应用CS-IGF-1C水凝胶包被的PMSCs可通过促进这些供体细胞释放PGE2,以极化M2巨噬细胞并伴随IL-10的上调,从而显著减轻小鼠结肠炎。
【图文】：

天津医科大学硕士学位论文 二、实验结果与分析二、结果实验结果与分析2.1 PMSCs 的特性2.1.1 PMSCs 的增殖能力及转染率我们对 P4 代的 PMSCs 进行慢病毒的转染，将转染后的 PMSCs 进行体外扩增培养并计数，扩增基数为 106，培养第 2 - 3 天后细胞达 90%以上融合度，消化计数传代，依此循环，我们发现转染后的 PMSCs 具有非常强的增殖能力，且其增殖曲线成指数型。流式细胞分析结果表明，GFP 阳性的细胞的数量占总细胞数量的 90.4%，即 PMSCs 的转染率为 90.4%。

（造血系干细胞标志）以及 CD31（内皮标志）的表达率分别为 1.04%和 2.37%。由此我们可以看出转染后的 PMSCs 仍然保持典型间充质干细胞的特点。图1.3 转染后PMSCs体外表征。A: 油红O染色 (I)；茜素红S染色 (II)；甲苯胺蓝染色 (III)。标尺=200 μm；B：P6 代 PMSCs 流式分析。2.1.4 PMSCs 体内示踪的条件为了在活体动物体内观察到存活的 PMSCs，我们将细胞转染了 GFP-Fluc 基因，GFP 的表达前文已述。我们将细胞按数量梯度接种到六孔板，加入萤火虫荧光素酶的底物 D-luciferin 后，放在小动物活体成像系统的暗箱内进行成像，，我
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574.62

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本文编号：2706782