益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株治疗小鼠急性溃疡性结肠炎的研究

发布时间：2020-06-14 11:41

【摘要】： 第一章益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株的特征分析 目的： 探讨益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株可能的药用价值、遗传稳定性和抗生素敏感性。 方法： 1．益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株的模拟胃肠环境的生存能力研究从湖南一泰公司种子库中选择菌株CMS-H002和CMS-H003，使用盐酸，胃蛋白酶和牛胆汁模拟人类胃肠道环境，分别测定两株益生菌对酸和胆汁的耐受能力。 2．益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株的遗传稳定性分析确定了菌株CMS-H002和CMS-H003具有较好的耐酸耐耐胆汁能力后，通过测定其G+C摩尔百分含量，评价这两株细菌的遗传稳定性。 3．益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株的抗生素敏感性分析采用琼脂纸片扩散法分别测定菌株CMS-H002和CMS-H003对抗生素的敏感程度。 结果： 1．益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株在PH值3.0和胆汁浓度0.5％的环境中培养4小时，细菌数(以吸光度表示)无明显减少；在PH值为2.5-3.5和胆汁浓度为0-5g／l的梯度培养基中培养4小时，细菌数也无明显减少；在人工胃肠环境中培养4小时，细菌数与培养前也无差异，分别是1×10~8和1×10~7。 2．益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株经过模拟胃肠生境后，其G+C摩尔百分含量分别是46.6％和47.2％，与初级鉴定的结果一致。 3．益生菌CMS-H002菌株在体外对羧苄青霉素、链霉素等33种抗生素敏感，对头孢呋肟等9种抗生素不敏感。益生菌CMS-H003菌株在体外对氯霉素等18种抗生素敏感，对庆大霉素等24种抗生素不敏感。 结论： 菌株CMS-H002和CMS-H003对酸和胆汁有抗性，CMS-H002在体外对羧苄青霉素、链霉素等33种抗生素敏感，对头孢呋肟等9种抗生素不敏感，G+C摩尔百分含量为46.6％。CMS-H003在体外对氯霉素等18种抗生素敏感，对庆大霉素等24种抗生素不敏感，G+C摩尔百分含量分别为47.2％。 第二章益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株的药效学研究 目的： 本部分实验主要进行益生菌CMS-H002和CMS-H003治疗UC的量效分析以及联用益生菌治疗UC的疗效评价和部分作用机制探讨。 方法： 1．UC模型的建立Balb／c小鼠自由饮用5％DSS(分子量5000)13天，建立改良右旋糖酐硫酸酯钠(Dextran Sulfate Sodium，DSS)诱导的小鼠UC模型。 2益生菌治疗UC的量效分析将Balb／c小鼠随机分为正常对照组、模型组、生理盐水组、巴柳氮组、CMS-H002高剂量组、CMS-H002中剂量组、CMS-H002低剂量组、CMS-H003高剂量组、CMS-H003中剂量组和CMS-H003低剂量组。正常对照组小鼠每日自由饮用消毒蒸馏水，其余各组小鼠每日自由饮用5％DSS，连续13天。制模同一天，正常对照组和模型组无任何处理；生理盐水组每日给0.4ml生理盐水灌胃；巴柳氮组按照每日8mg／10g体重灌胃；CMS-H002高、中和低剂量组每日分别按照4.0×10~9cfu，4.0×10~7cfu，4.0×10~5cfu／10g体重灌胃一次，CMS-H003高、中和低剂量组每日分别按照4.0×10~7cfu，4.0×10~5cfu，4.0×10~3cfu／10g体重灌胃一次。每日观察小鼠的体重、粪便性状及隐血。13天后处死各组小鼠，测量结肠长度，留取各组结肠标本，行HE染色并观察光镜下结肠组织学病理变化。 3．联合用药的治疗观察将小鼠随机分为正常对照组、模型组、生理盐水组、巴柳氮组、CMS-H002组、CMS-H003组及联合用药组。制模方法同上。制模同一天，正常对照组和模型组无任何处理；生理盐水组每日给0.4ml生理盐水灌胃；巴柳氮组每日按照8mg／10g体重灌胃；CMS-H002组每日按照4×10~9cfu／10g体重灌胃一次；CMS-H003组每日按照4×10~7cfu／10g体重灌胃一次；联合用药组每日按照CMS-H0024×10~9cfu／10g体重和CMS-H003 4×10~7cfu／10g体重灌胃一次。每日观察小鼠的体重、粪便性状及隐血。于制模前一天和最后一天，分别留取每只小鼠粪便行菌群分析。13天后处死各组小鼠，测量结肠长度及重量，光镜下观察结肠组织学病理变化，电镜下观察结肠组织超微结构的改变，生化测定结肠组织中髓过氧化物酶含量的变化。 结果： 1．益生菌治疗UC的量效分析结果饮用5％DSS13天后小鼠结肠结肠长度由10.85缩短至8.65cm(P＜0.05)，DAI由0增至8.4。用益生菌CMS-H002和CMS-H003分别干扰饮用DSS的小鼠后，结肠长度与干扰剂量成正比，DAI与干扰剂量成反比。益生菌CMS-H002和CMS-H003的量越大其结肠长度和DAI越接近正常。低剂量组小鼠结肠长度和DAI变化趋势接近于巴柳氮干预组，比盐水干预组好(P＜0.05)。综合分析实验结果，菌株CMS-H002和CMS-H003高剂量组对小鼠的一般情况、结肠病理变化的影响更优于中剂量组。 2．联合用药的治疗效果联合用药后，小鼠的一般情况、病理变化改善最为明显。表现为两菌合用组的结肠长度最长为9.98cm，结肠重量最轻为0.142g／g，DAI维持在最低水平为1.0-2.0，组织学评分最低为1.9，这也与光镜下组织病理改变和电镜下超微结构改变一致。 3．初步机制探讨结果 1)肠道菌群分析的结果显示：UC小鼠肠道菌群发生了紊乱，表现为乳酸杆菌数量明显减少(P＜0.01)，肠球菌和大肠杆菌数量不同程度增加(P＜0.01)，拟杆菌、双歧杆菌和金葡菌菌数无明显变化。给与益生菌治疗后，以两菌合用组肠道菌群构成更接近正常菌群，表现为乳酸杆菌、丁酸梭菌和双歧杆菌菌数明显增加(P＜0.01)，而大肠杆菌和肠球菌菌数明显减少(P＜0.01)，金葡菌和拟杆菌菌数无明显变化。生理盐水和巴柳氮对肠道菌群无影响。 2)肠组织MPO活力测定的结果显示：饮用5％DSS13天的小鼠肠组织MPO的活力明显增高。除生理盐水组外，其它治疗组均可明显降低肠组织MPO的活力(P＜0.01)，以两菌合用组MPO活力最低，与单用组比较有差异(P＜0.05)。 结论： 1．改良的DSS诱导UC动物模型不仅继承了原制模方法准确可靠、方法简单、成本低、重复性好，短期内出现明显症状及结肠炎典型病理变化的特点，还具有死亡率低，适用于中重度UC模型研究的优点。 2．口服益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株具有治疗DSS诱导的Balb／c小鼠急性UC的作用，疗效随剂量的增加而增强。两菌联合治疗作用优于单菌，优于巴柳氮。抗炎和调节肠道菌群可能是它们发挥治疗UC作用的部分机制。 第三章联用益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株治疗UC的机制 目的： 本部分实验主要进行联用益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株治疗UC的机制研究。 方法： 将留取的各组结肠标本，分别应用免疫组化染色、酶联免疫吸附法、免疫印记和半定量RT-PCR技术检测小鼠结肠黏膜内细胞因子EMAP-Ⅱ、TNF-a、IL-1β、IL-6、MCP-1、KC、P-selection、TF、PCNA和Caspase-1的表达。 结果： 1．饮用5％DSS13天的小鼠肠粘膜中EMAP-Ⅱ、TNF-a、IL-1β、IL-6、MCP-1、KC、P-selection、TF和Caspase-1表达明显上调(P＜0.05)，PCNA明显下调(P＜0.05)。 2．给予益生菌和巴柳氮干预后可明显阻止肠粘膜EMAP-Ⅱ、TNF-a、IL-1β、IL-6、MCP-1、KC、P-selection、TF和Caspase-1的表达，同时促进PCNA表达(P＜0.05)。 3．两菌合用组阻止EMAP-Ⅱ、TNF-a、IL-1β、IL-6、P-selection、TF、PCNA和Caspase-1表达的作用优于益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株各单用组(P＜0.05)。 结论： 1．益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株可能是通过减轻炎症，抑制血栓，抑制凋亡和促进增殖发挥其部分治疗UC的作用。 2．EMAPⅡ参与了UC的发病过程，它可能是通过其自身促炎、趋化特性启动炎症，并上调其它促炎细胞因子、粘附因子、组织因子放大炎症导致UC非特异性炎症的组织学改变。益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株可能通过下调它的表达发挥其部分治疗作用。 3．两菌合用组结肠粘膜中EMAP-Ⅱ、TNF-a、IL-1β、IL-6、P-sel、TF和Caspase-1的表达低于单用益生菌治疗组，这可能是益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株合用对UC发挥协同治疗作用的分子机制。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R574.62
【图文】：

1.0:0.450:0.515。 2.2.3标准碱基和待样品侧定色谱图图1一10为标准碱基溶液反相高效液相色谱的分离结果，从色谱峰的高度、宽度和基线可以看出四种碱基完全分离，峰形良好，无杂质峰，说明该条件完全符合G+c摩尔百分含量测定的要求，四种碱基出峰的时间:胞啥淀(C)为4.639min;鸟嚎吟(G)为10.073min;胸腺啥睫(T)为13.583;腺嚓吟(A)为17.18Omin。图1一11、图1一12为待测样品的测定结果，因样品DNA经过酶的处理可见数个杂峰，但可与四种碱基完全分离，因而不会影响测定的结果。﨑圈.食n.竹口自24‘.劝口璐图l一10标准碱基溶液分离图语注:1、2、3、4分别代表C、G、T、A拍均匀.如，峰尖上的数字为出峰的时间.M伪认伪t.N认M.工寸.协寸卜0.州价.入协伪.寸拍衅巧50.SL一一且一一一一一一习， 3691215图1一n菌株cMS一H002碱基溶液分离图语 1821一i。注:1、2、3、4分别代表C、G、T、A

1.0:0.450:0.515。 2.2.3标准碱基和待样品侧定色谱图图1一10为标准碱基溶液反相高效液相色谱的分离结果，从色谱峰的高度、宽度和基线可以看出四种碱基完全分离，峰形良好，无杂质峰，说明该条件完全符合G+c摩尔百分含量测定的要求，四种碱基出峰的时间:胞啥淀(C)为4.639min;鸟嚎吟(G)为10.073min;胸腺啥睫(T)为13.583;腺嚓吟(A)为17.18Omin。图1一11、图1一12为待测样品的测定结果，因样品DNA经过酶的处理可见数个杂峰，但可与四种碱基完全分离，因而不会影响测定的结果。﨑圈.食n.竹口自24‘.劝口璐图l一10标准碱基溶液分离图语注:1、2、3、4分别代表C、G、T、A拍均匀.如，峰尖上的数字为出峰的时间.M伪认伪t.N认M.工寸.协寸卜0.州价.入协伪.寸拍衅巧50.SL一一且一一一一一一习， 3691215图1一n菌株cMS一H002碱基溶液分离图语 1821一i。注:1、2、3、4分别代表C、G、T、A

【参考文献】

相关期刊论文 前3条

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2 王群英,陈村龙,王继德,马强,赖卓胜,张亚历;溃疡性结肠炎小鼠模型肠粘膜中细胞因子的表达和核转录因子κB的激活[J];第一军医大学学报;2003年11期

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本文编号：2712733