肝纤维化小鼠内皮祖细胞归巢肝脏机制及3.0-T磁共振示踪研究
发布时间:2020-06-14 14:09
【摘要】: 第一部分C57小鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离、培养和鉴定 目的:探讨C57小鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)的分离、培养和鉴定方法。 材料与方法:取C57小鼠股骨骨髓,采用密度梯度离心法Histopaque 1083分离出小鼠骨髓单个核细胞,在含有10%FBS、20ng/ml VEGF、1ng/ml bFGF的M199培养基中进行体外诱导、分化和扩增。培养7天后,去除未贴壁细胞,进行细胞鉴定,应用流式细胞仪检测Sca-1及Flk-1(VEGF-R2);荧光倒置显微镜观察EPCs吞噬DiI标记的乙酰低密度脂蛋白(DiI-AcLDL)和FITC标记的荆豆凝集素-1(FITC-UEA-1);血管形成实验鉴定内皮祖细胞血管形成能力。 结果:在内皮条件下培养的骨髓源性单个核细胞,24h后逐渐贴壁,并逐渐伸出伪足样突起,呈小杆状或梭形,培养第4天贴壁细胞开始增殖,呈“集落”样生长,外周梭形细胞较多,第7天梭形细胞显著增多,部分视野观察到梭形细胞首尾相连形成条索样结构;细胞培养7天后流式细胞仪检测细胞Flk-1及Sca-1双阳性率达60.06±4.96%;细胞摄取DiI-acLDL呈红色,摄取UEA-1呈绿色,双阳性细胞成黄色,阳性率达89.03±6.11%;血管形成实验显示EPCs在ECMatrix~(TM)胶体上能形成管状血管结构。 结论:通过本研究分离、培养方法可从C57小鼠骨髓中获得较高纯度的EPCs,且具有内皮细胞的特征和功能。 第二部分评价SDF-1α/CXCR4在四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠EPCs归巢中的作用 目的检测四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化小鼠模型肝脏SDF-1α/CXCR4及骨髓来源内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)CXCR4受体的表达,评价SDF-1α/CXCR4轴在EPCs肝纤维化归巢中的作用。 方法选用6周龄雌性纯系C57小鼠,采用40%的CCl4/橄榄油溶液腹腔注射,剂量为1ml/kg,每周2次,共4周,制成肝纤维化模型,取肝纤维化及正常对照组小鼠肝脏标本,采用RT-PCR及免疫组化检测SDF-1α的表达,采用RT-PCR及Western检测CXCR4受体的表达:分离、培养骨髓来源的EPCs,采用Transwell小室检测BM-EPCs对SDF-1α的迁移功能,流式细胞术检测BM-EPCs CXCR4的表达。 结果与对照组相比,SDF-1α及CXCR4在肝纤维化模型小鼠肝脏组织中的表达较对照组明显上调,差异具有统计学意义(P<0.05);BM-EPCs CXCR4的表达阳性率为(69.35%±16.04%),Transwell迁移实验显示,BM-EPCs向SDF-1α的迁移数量是158.40±12.66/高倍视野,明显高于正常组(87.80±14.24/高倍视野)((P<0.01,t=8.29),在体外经CXCR4受体抑制剂AMD3100处理后,BM-EPCs向SDF-1α迁移的数量显著减少(92.60±13.59/高倍视野)(P<0.01)。 结论SDF-1α/CXCR4轴在EPCs肝纤维化归巢中具有重要作用,为EPCs移植治疗肝纤维化提供了理论基础。 第三部分3.0-T磁共振R2~*和R2 mapping在SPIO标记内皮祖细胞向肝纤维化肝脏归巢的活体定量示踪研究 目的:评价临床用3.0T磁共振R2~*和R2 mapping定量示踪SPIO标记的内皮祖细胞(EPCs)向肝脏归巢。 方法:C57小鼠骨髓来源EPCs培养7d,并进行标记物鉴定,进行氧化铁颗粒-鱼精蛋白(FE-PRO)标记。用电镜和普鲁士蓝染色来评价铁颗粒摄取。制做不同浓度标记细胞(0-2.0×10~6/ml)的1.0%琼脂糖模型,并采用临床用3.0T磁共振进行R2和R2~*测定;活体示踪:选用纯系C57小鼠(雌性,6周龄,体重19g-20g),腹腔内注射40%CCL4橄榄油溶液制成肝纤维化模型,经鼠尾静脉注射5.0×10~6个SPIO标记的EPCs悬液(0.5ml),在注射前及注射后2h、4d、8d及12d行磁共振扫描测定肝脏R2~*和R2值,对照组小鼠接受同样剂量SPIO标记和未标记的EPCs移植,并行磁共振扫描,移植后12d所有小鼠均处死行组织病理学观察。 结果:电镜和普鲁士蓝染色显示SPIO铁颗粒标记率达95%以上,与正常细胞相比未见细胞器结构损伤;R2和R2~*值与琼脂糖凝胶模型中标记细胞的数量成正比(r分别为0.98及0.99,P<0.01),R2~*效应较R2效应明显(P<0.01);活体磁共振细胞示踪成像显示,肝纤维化及正常小鼠肝脏R2~*值在注射SPIO标记的EPCs后2h、4d、8d均明显高于对照组(P均小于0.05),R2~*值随时间延长逐渐减低;注射标记SPIO的细胞后肝纤维化小鼠肝脏R2~*值在注射后2h、4d、8d均明显高于正常组(P均小于0.05);肝纤维化及正常小鼠肝脏R2值在注射SPIO标记的EPCs后2h及4d均明显高于对照组(P均小于0.05),R2值亦随时间延长逐渐减低;肝纤维化小鼠肝脏R2值在注射SPIO标记的EPCs后各时间段与正常组无明显差别(P均大于0.05);各组小鼠的R2~*值均明显高于R2值,具有统计学差异(P<0.05)。 结论:3.0T MR R2~*和R2 mapping能定量示踪移植细胞向肝脏归巢,R2~*mapping优于R2mapping,为临床细胞移植治疗提供了一种无创、准确的示踪方法。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R575.2
【图文】:
四.细胞培养方法1.骨髓单个核细胞的分离采用密度梯度离心法(图1一l),具体步骤为:将小鼠颈椎脱臼法处死,75%乙醇浸泡15分钟,在超净台内无菌条件下剪取双下肢股骨和胫骨,将srul注射器接lml注射器针头,吸取预冷至4℃的PBS液冲洗股骨及胫骨骨髓腔,直至冲洗液清亮或骨髓腔变白,反复吹打冲洗液以获得单细胞悬液,然后将骨髓单细胞悬液缓慢滴加在 Histopaquel083淋巴细胞分离液上,冲洗液与分离液的体积比为2:1
..!户口C图卜7共检测6组细胞,每组细胞测定二次,结果显示Sca一1/Flk一1双l朴哇率为60.06十4.%%图1一8图1一9图l一10图1一8荧光倒置显微镜观察细胞吞噬Dil一LDL星红色;色。(放大倍数400x)细胞吞噬FITC一uEA一l旱绿色;图1一9荧光倒置显微镜观察荧光倒置显微镜示细胞吞噬DII一LOL及FITC一UEA一1双染旱黄22
本文编号:2712898
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R575.2
【图文】:
四.细胞培养方法1.骨髓单个核细胞的分离采用密度梯度离心法(图1一l),具体步骤为:将小鼠颈椎脱臼法处死,75%乙醇浸泡15分钟,在超净台内无菌条件下剪取双下肢股骨和胫骨,将srul注射器接lml注射器针头,吸取预冷至4℃的PBS液冲洗股骨及胫骨骨髓腔,直至冲洗液清亮或骨髓腔变白,反复吹打冲洗液以获得单细胞悬液,然后将骨髓单细胞悬液缓慢滴加在 Histopaquel083淋巴细胞分离液上,冲洗液与分离液的体积比为2:1
..!户口C图卜7共检测6组细胞,每组细胞测定二次,结果显示Sca一1/Flk一1双l朴哇率为60.06十4.%%图1一8图1一9图l一10图1一8荧光倒置显微镜观察细胞吞噬Dil一LDL星红色;色。(放大倍数400x)细胞吞噬FITC一uEA一l旱绿色;图1一9荧光倒置显微镜观察荧光倒置显微镜示细胞吞噬DII一LOL及FITC一UEA一1双染旱黄22
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 张文夺,符伟国,徐欣,王玉琦,夏蓓莉,汪圣毅;脐血内皮祖细胞的分离和培养[J];中国临床医学;2005年01期
2 Claudia Rubie;Vilma Oliveira Frick;Mathias Wagner;Christina Weber;Bianca Kruse;Katja Kempf;Jochen K銉nig;Bettina Rau;Martin Schilling;;Chemokine expression in hepatocellular carcinoma versus colorectal liver metastases[J];World Journal of Gastroenterology;2006年41期
3 石立兴;张继武;;光学分子影像学及其应用[J];中国医学影像技术;2008年12期
本文编号:2712898
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