布拉氏酵母菌对小鼠实验性结肠炎的疗效及相关机制

发布时间：2020-06-15 06:46

【摘要】：目的:炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性炎症紊乱,发病机制不清。研究证实慢性炎症中存在着粘膜缺氧,为了应对缺氧胁迫,生物有机体形成了一系列的调节机制。在多种调节途径中,缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors,HIFs)是最主要的能够应答细胞内氧气浓度的降低而对多种基因进行调控的转录因子家族,与生物体的生长、发育及一些疾病的发病机理都存在着密切的关系。目前研究比较深入的包括HIF-1α和HIF-2α。研究证实IBD患者中发现HIF-1α和HIF-2α强烈激活。HIF-1α在IBD的发病机制中可能发挥双重作用,既参加了损伤过程同时也表现了其保护作用。HIF-1α还对上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)相关转录因子Twist、Snail、Slug具有调控作用。EMT对于IBD发病有重要作用,抑制EMT对于改善IBD临床症状有潜在作用。HIF-2α通过TNF促进上皮炎症反应。HIF-2α还可调控VEGF的表达,诱导新生血管形成。同时,肠道菌群在IBD发病中的作用日渐引人注目。布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii,Sb)是一种嗜热的非致病性的酵母菌,数十年来应用于保护小肠损伤和炎症。最近的临床研究表明它在IBD中也许有作用,然而,作用机制不清。本研究主要探讨Sb对小鼠实验性结肠炎的疗效及其对缺氧诱导因子的影响。方法:50只BALB/c小鼠随机分为五组:(1)正常对照组:正常饮食,无特殊处理;(2)UC模型组:自由饮用3.5%DSS溶液7天造模;(3)Sb治疗组:Sb溶液灌胃14天,后7天同时自由饮用3.5%DSS溶液;(4)生理盐水(NS)对照组:NS灌胃14天,后7天同时自由饮用3.5%DSS溶液;(5)Sb对照组:Sb溶液灌胃14天。实验期间每日观察小鼠进食、饮水、活动等一般情况,称量体重,观察粪便性状及粪便隐血、便血情况,计算DAI积分,评估结肠炎严重程度。采用HE染色检测小鼠结肠组织损伤情况,并进行组织损伤评分。采用免疫组化法检测紧密连接蛋白(occludin、claudin-1)、HIFs(HIF-1α和HIF-2α)及其相关蛋白(E-cadherin、vimentin)的表达与分布情况,并分别采用Real-time PCR和Western Blot方法检测各组小鼠结肠组织中紧密连接蛋白(occludin、claudin-1)、ITF、HIFs(HIF-1α和HIF-2α)及其相关蛋白(E-cadherin、vimentin、VEGF、IL-6)的mRNA和蛋白表达水平。结果:1、Sb治疗组小鼠实验性结肠炎症状缓解明显,DAI评分较模型组降低。2、光镜下观察发现Sb治疗组大鼠组织损伤评分较模型组降低。3、Occludin:RT-PCR、免疫组化与WB显示,与正常对照组相比,UC模型组和NS组occludin的mRNA以及蛋白表达明显降低,Sb治疗组减轻了DSS引起的occludin的mRNA以及蛋白表达的降低,Sb对照组与正常对照组无明显差别。4、claudin-1:RT-PCR显示:与正常对照组相比,UC模型组和NS组claudin-1mRNA无明显改变,Sb治疗组和Sb对照组claudin-1 mRNA明显增加。免疫组化与WB显示:与正常对照组相比,UC模型组和NS组claudin-1蛋白表达与分布明显降低,Sb治疗组减轻了DSS引起的claudin-1蛋白表达与分布的降低,Sb对照组与正常对照组无明显差别。5、ITF:RT-PCR检测显示,UC模型组与NS组小鼠结肠组织中ITF mRNA的表达水平较正常对照组降低,Sb治疗组和Sb对照组小鼠结肠组织中ITF mRNA的表达水平明显升高。6、HIF-1α:RT-PCR检测显示,UC模型组与NS组小鼠结肠组织中HIF-1αmRNA的表达与正常对照组相似,Sb治疗组和Sb对照组小鼠结肠组织中HIF-1αmRNA的表达水平明显降低。免疫组化显示:在正常对照组小鼠和Sb对照组小鼠的结肠组织中,免疫染色显示HIF-1α弥散分布。在模型组小鼠和NS组小鼠中,核HIF-1α染色明显增加,Sb治疗组小鼠的结肠组织中核HIF-1α染色较UC模型组有所降低。WB结果显示,正常对照组和Sb对照组小鼠结肠组织HIF-1α处于低水平表达;模型组小鼠和NS组小鼠结肠组织HIF-1α表达增加;Sb治疗组小鼠结肠组织HIF-1α表达与UC模型组比较明显降低。7、E-cadherin:RT-PCR、免疫组化与WB显示:与正常对照组相比,UC模型组和NS组E-cadherin的mRNA以及蛋白表达明显降低,Sb治疗组减轻了DSS引起的E-cadherin的mRNA以及蛋白表达的降低,Sb对照组与正常对照组无明显差别。8、vimentin:RT-PCR、免疫组化与WB显示:与正常对照组相比,UC模型组和NS组vimentin的mRNA以及蛋白表达明显增加,Sb治疗组减轻了DSS引起的vimentin的mRNA以及蛋白表达的增加,Sb对照组vimentin的mRNA以及蛋白的表达与正常对照组无明显差别。9、HIF-2α:RT-PCR检测显示,UC模型组与NS组小鼠结肠组织中的HIF-2αmRNA的表达较正常对照组明显升高,Sb治疗组小鼠结肠组织中HIF-2αmRNA的表达水平比模型组明显降低。Sb对照组HIF-2αmRNA与正常对照组没有明显差别。免疫组化显示,在正常对照组小鼠和Sb对照组小鼠的结肠组织中,免疫染色显示HIF-2α弥散分布,在模型组小鼠和NS组小鼠中,核HIF-2α染色明显增加,Sb治疗组小鼠的结肠组织中核HIF-2α染色较UC模型组有所降低。WB结果显示,正常对照组和Sb对照组小鼠结肠组织HIF-2α处于低水平表达;UC模型组小鼠和NS组小鼠结肠组织Sb表达明显增加;Sb治疗组与UC模型组比较明显降低。10、VEGF:免疫组化与WB显示,正常对照组小鼠结肠组织中VEGF表达量很低,UC模型组和NS组VEGF表达明显增加,Sb治疗组VEGF较UC模型组明显下降。Sb对照组VEGF表达量与正常对照组没有明显差别。11、IL-6:WB显示,正常对照组小鼠结肠组织中IL-6表达量很低,UC模型组IL-6表达明显增加,Sb治疗组IL-6表达量较UC模型组明显下降。结论:1、实验性结肠炎小鼠存在腹泻、黏液血便、体重减轻等症状,DAI评分明显增高,结肠黏膜存在炎症性改变,组织损伤评分明显增高,结肠黏膜紧密连接蛋白(occludin和claudin-1)和粘液层ITF表达减少。2、Sb可明显改善实验性结肠炎小鼠的腹泻、黏液血便、体重减轻等症状和降低DAI评分,有效减少肠黏膜的炎症,降低组织损伤评分,增加结肠黏膜紧密连接蛋白(occludin和claudin-1)和粘液层ITF表达水平。3、Sb可降低实验性结肠炎小鼠结肠组织中的HIF-1α的蛋白的表达水平,继而改善EMT,改善结肠炎。4、布拉氏酵母菌可降低实验性结肠炎小鼠结肠组织中的HIF-2α的mRNA及蛋白的表达水平,继而降低VEGF和IL-6等前炎症因子的表达,改善结肠炎。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574.62
【图文】：

变化情况图,变化情况,小鼠,活动程度

各组小鼠体重变化情况3.2 DAI 评分参考 Hamamoto 等的方法对每只小鼠进行 DAI 评分，观察指标包括体重下降大便性状和粪便隐血情况。正常对照组和 Sb 对照组的 DAI 评分始终稳定在零水平UC 模型组小鼠炎症活动程度逐渐加重，NS 组与 UC 模型组的 DAI 评分趋势一致示生理盐水不能阻止病情的发展。Sb 治疗组则有较好治疗效果， DAI 评分明低于 UC 模型组。以服用 DSS 溶液后第 7 天 DAI 评分作比较分析，UC 模型组NS 组基本一致，Sb 治疗组明显降低，有统计学差异（P＜0.05）。（见表 4，图表 4，各组小鼠 DAI 评分（X±SD）组别 DAI 评分正常对照组 0.0413±0.11667

直方图,小鼠,情况,组织学

各组小鼠 DAI 评分情况（* P<0.05 VS 正常组；# P<0.05 VS 模型组）3.3 组织损伤评分对每只小鼠的结肠病理切片进行组织学损伤学评分，参照 Dieleman，LA 等的评分标准[20]。图 3 为各组小鼠服用 DSS 溶液后第 7 天的结肠组织损伤评分直方图由图可见，正常对照组和 Sb 对照组小鼠肠黏膜组织损伤评分很低，其余各组饮用3.5% DSS 7 天后的组织损伤评分均有不同程度升高。NS 组与 UC 模型组损伤的严重程度一致。Sb 治疗组能明显减轻结肠组织的损伤，表现为炎症浸润、病变深度隐窝破坏均不同程度减轻（P＜0.05）。（见表 5，图 3）表 5，各组小鼠结肠组织学损伤评分表（X±SD）组别组织损伤评分正常对照组 0.6667±1.32288

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