皮蛋蛋白源性抗肠炎肽的筛选及其作用机制研究

发布时间：2020-06-17 04:40

【摘要】：炎症性肠病是发生在肠道的慢性且反复发作的炎性疾病。传统的药物治疗虽能缓解临床症状但却存在一定的副作用。蛋源性活性组分是近期食品科学领域研究的热点之一,禽蛋组分的抗菌、抗病毒、降血压、抗氧化、抗炎以及免疫调节等功能活性已被相继证实。蛋源性活性组分的开发应用有望为炎症性肠病提供新的治疗策略。我们的前期研究表明皮蛋蛋白仿生酶解产物(Simulated gastrointestinal digestion of preserved egg white,SGD-PEW)具有缓解葡聚糖硫酸钠(Dextransulfatesodium,DSS)诱导的小鼠结肠炎炎症进程的作用,同时其可以抑制TNF-α诱导的Caco-2细胞白细胞介素8(Interleukin-8,IL-8)的分泌及炎性细胞因子的基因表达。但是其抗炎的物质基础及作用机制尚不明确。因此需探讨其抗炎物质基础和抗炎机制,以期为以皮蛋蛋白源性多肽为基础的新型抗肠道炎症膳食策略提供理论参考。首先使用肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的Caco-2细胞的体外炎症模型评价皮蛋蛋白源性多肽的抗炎作用。结果显示,皮蛋蛋白源性多肽DEDTQAMPFR(DR-10)、DEDTQAMPF(DF-9)、MLGATSL(ML-7)和MSYSAGF(MF-7)在0.25 mg/mL的浓度下显著下调IL-8的分泌。此外,这四个多肽在TNF-α诱导的Caco-2细胞中能够显著抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β和IL-12的基因表达,并促进抗炎细胞因子IL-10的基因表达。同时DR-10、DF-9、ML-7和MF-7显著抑制c-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK)的磷酸化,而DR-10和DF-9显著降低Kappa B抑制剂(Kappa B inhibitor,IκB)和p38的磷酸化水平。这些结果表明ML-7和MF-7通过丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号途径发挥其抗炎活性。然而DR-10和DF-9抑制TNF-α诱导的Caco-2细胞中的核转录因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)和MAPK信号传导途径。进一步通过DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型测定DR-10、ML-7、SR-7和MF-7在体内的抗炎作用。结果显示,DR-10、ML-7、SR-7和MF-7显著改善了DSS诱导的小鼠结肠炎的临床症状、如体重减轻、疾病活动指数升高、结肠缩短、脾脏肥大和组织学评分增加。在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中灌胃DR-10、ML-7、SR-7和MF-7治疗也显著抑制促炎细胞因子TNF-α和IL-6局部分泌,并显著下调促炎细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β、干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)和单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)的基因表达。总体而言,MF-7在四种肽中显示出最佳的减轻DSS诱导的结肠炎的效果。综上所述,皮蛋蛋白源性多肽MF-7、DR-10、ML-7和SR-7在体外和体内都具有良好的抑制炎症的作用。因此,皮蛋蛋白源性多肽MF-7、DR-10、ML-7和SR-7具有良好的抗炎生物活性,这些结果表明MF-7、DR-10、ML-7和SR-7可能是治疗炎性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)的潜在有希望的候选者。
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R574
【图文】：

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N. neutrophil，中性粒细胞；NK. natural killer cell，自然杀伤细胞；M. macrophages，巨噬细胞IECS. intestinal epithelial cells，人肠上皮细胞；TGF-β. transforming growth factor-β，转化生长因子-β。图 1.1 炎症性肠病的发病机制示意图Fig 1.1 Schematic representation of the pathogenesis involved with inflammatory bowel disease1.3 炎症性肠病的传统治疗方法和膳食介导策略的比较目前炎症性肠病的传统治疗方案主要从控制活动性炎症和调节免疫紊乱两方面着手，常用的药物有水杨酸类、类固醇激素类和免疫抑制剂 3 类。水杨酸类药物如美沙拉嗪是目前轻中度 UC 患者诱导缓解以及维持治疗的主要药物，但其作用有限且伴有恶心、肠道不适等不良反应。同时该药物最适诱导缓解剂量仍有争议，且维持治疗的剂量也无统一标准[17]。糖皮质激素可迅速抑制炎症，但不可用于维持治疗同时还会伴有对激素的依赖[18]。硫唑嘌呤可用于难治性 CD 的诱导缓解治疗，因为其代谢产物可以抑制嘌呤合成，从而抑制 T 淋巴细胞和浆细胞的作用，同时可促进T 细胞凋亡[19]；但是该药物的使用会增加患淋巴瘤的风险，停药后患者白细胞计数减少。硫唑嘌呤不耐受或无效患者的诱导和维持缓解治疗常用甲氨蝶呤，甲氨蝶呤

氨基酸序列,字母,显著性差异,标准差

SGD-PEW和SGD-PEWP在TNF-α-induced Caco-2细胞中抑制IL-8分泌作用均值±标准差表示（n=4），不同的字母代表代表显著性差异，p<0.05. Effects of SGD-PEW or SGD-PEWP on inhibiting IL-8 secretion in TNF-α-indu. Date are presented as mean ± SEM (n = 4). Values without common letter are signdifferent at p<0.05.蛋蛋白源性多肽的纯化及鉴定图 2.2 所示，经过超滤后的组分使用 RP-HPLC 进一步纯化以获得相C-MS/MS 鉴定 RP-HPLC 分离组分的氨基酸序列如图 2.3。如表 2.2 2 中共鉴定了六种源自卵清蛋白，syntaxin 7 和 von willebrand 因子的白蛋白衍生肽 DR-10 和 DF-9 与之前已被证明具有抗氧化活性QAMP 具有相似的氨基酸序列[79]。源自卵清蛋白的肽 LL-8 类似于具多肽 LPDEVSG[79]。其他肽如 ML-7、MF-7 和 SR-7 是新鉴定出的未序列的多肽。然后合成这些多肽。

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