异甘草素在缓解实验小鼠慢性胰腺炎中的分子机制研究

发布时间：2020-06-18 06:43

【摘要】：第一章:异甘草素对实验小鼠慢性胰腺炎的保护作用【目的】通过建立慢性胰腺炎小鼠模型,观察异甘草素(ILG)对小鼠胰腺组织的影响。【方法】将小鼠随机分为对照组、造模组和治疗组,采用反复腹腔注射雨蛙素的方法构建小鼠慢性胰腺炎模型,在造模后半程给予小鼠ILG灌胃治疗。每周一次体重测量并观察小鼠体重及胰重/体重的变化。通过组织切片HE染色及天狼星红染色判断造模是否成功。利用PCR检测小鼠胰腺组织中纤维化相关因子(FN、α-SMA、COL-1)及炎症相关因子(CCL2、CD68、F4/80、TNF-α和IL-6)的mRNA水平表达情况。观察ILG对小鼠肝脏功能及其他脏器(肝脏、肺脏、肾脏和心脏)组织学影响。【结果】造模组小鼠平均体重较对照组显著降低(21.4±0.81g vs 24.2±0.66g,p0.01);治疗组小鼠平均体重较造模组显著升高(22.9±0.42g vs 21.4±0.81g,p0.01)。胰腺重量/体重方面,造模组较对照组降低(1.73±0.29 vs 4.87±0.55,p0.01),而治疗组较造模组显著上升(3.37±0.53 vs 1.73±0.29,p0.01)。胰腺HE染色及天狼星红染色均显示造模成功,造模组小鼠胰腺腺泡细胞大量减少并伴有“管状复合物”形成,间质中可见胶原纤维沉积及炎细胞浸润。治疗组则有显著改善和恢复,腺泡萎缩、胶原沉积及炎细胞浸润均不同程度减轻。造模组升高表达的纤维化标志物(α-SMA、FN、COL-1)及相关炎症因子(CCL2、CD68、F4/80、TNF-α和IL-6)均在治疗组中不同程度降低。此外,ILG未引起血糖(Glu)、谷丙转氨酶(ALT)、总胆固醇(T-CHO)及甘油三酯(TG)血清学水平以及肝、肺、肾、心组织学水平改变。【结论】(1)ILG灌胃治疗可显著升高CP模型小鼠的体重及胰腺重量/体重;(2)ILG灌胃治疗可显著改善CP模型小鼠胰腺组织的病理改变,同时抑制纤维化相关因子及炎症相关因子的表达;(3)ILG灌胃治疗不引起Glu、ALT、T-CHO及TG的血清学水平改变,同时在肝、肺、肾、心的组织学水平也不产生影响。第二章:异甘草素抑制胰腺星状细胞活化的分子机制研究【目的】探讨异甘草素(ILG)对PSCs活化的影响及其潜在的作用靶点和机制【方法】采用CCK8法检测ILG对PSCs的细胞存活率影响并获得适宜的浓度范围。将ILG单独作用于静息状态或加用TGF-β刺激后的人PSCs,以等体积的DMSO作为对照,运用PCR、Western blot及免疫荧光技术检测PSCs活化指标FN、α-SMA、COL-1及CTGF的表达水平。通过划痕实验、Transwell实验及流式细胞技术,观察ILG对PSCs迁移及凋亡的影响。通过转录组基因测序技术寻找ILG作用于PSCs的潜在靶基因和信号通路并加以验证。【结果】CCK8结果显示ILG作用于PSCs的适宜浓度范围为0~20μM。PCR、Western blot及细胞免疫荧光结果显示,ILG处理后可抑制PSCs内FN、α-SMA、COL-1及CTGF的升高。划痕实验显示ILG作用后,PSCs迁移距离减少,划痕相对宽度分别为5μM:1.04±0.17(p0.05);10μM:2.31±0.18(p0.01);20μM:3.70±0.23(p0.01)。Transwell实验也显示ILG作用后,穿过小室膜的细胞数目显著下降(5μM 72±13%,p0.05;10μM 41±6%,p0.01;20μM 14±3%,p0.01)。流式细胞技术检测发现,ILG可促进PSCs的凋亡。转录组基因测序发现,ILG作用PSCs后IL-1β、CCL2、PDGFB表达降低的同时DUSP5表达升高。通过验证发现,ILG可显著降低PSCs内MAPK通路中ERK1/2和JNK1/2的磷酸化水平并抑制下游c-Jun的核转位。同时,ILG还降低了PSCs的PDGFR磷酸化水平并升高了DUSP5、DUSP10的表达。【结论】(1)ILG抑制PSCs活化、迁移,促进其凋亡;(2)ILG抑制PSCs内IL-1β,CCL2,PDGFB表达的同时促进DUSP5的表达;(3)ILG通过降低PDGFR的磷酸化水平及升高DUSP5、DUSP10的表达来抑制MAPKs通路中JNK1/2和ERK1/2的磷酸化,最终导致PSCs的活化被抑制。第三章:异甘草素调控巨噬细胞极化的机制研究【目的】探讨异甘草素(ILG)对巨噬细胞极化的影响及其在PSCs与巨噬细胞通讯中的作用。【方法】将ILG作用于RAW264.7后,采用CCK8法检测其对细胞存活率的影响并获得适宜浓度范围。选取该浓度范围内的ILG预处理RAW264.7,用LPS和IL-4分别诱导RAW264.极化,采用PCR和Western blot检测不同诱导方式下,RAW264.7的极化类型及其相关分子标志物的变化。利用LPS短时刺激RAW264.7后观察ILG的作用通路变化。最后用PCR检测ILG对PSCs内炎症相关因子表达的影响,利用PSCs的上清液刺激RAW264.7,观察其极化改变情况及ILG的作用。【结果】CCK8结果显示ILG作用于RAW264.7的适宜浓度范围为0~20μM。PCR和Western blot显示,ILG可抑制LPS诱导后RAW264.7内CD86、IL1-β、TNF-α、iNOS和IL-6的表达,而对经IL-4诱导后,RAW264.7内升高表达的Arg-1、CD206、CD301和TGF-β无显著影响。短时LPS刺激后,Western blot检测显示RAW264.7内IκBα蛋白水平降低的同时p65和IκBα的磷酸化水平升高,ILG预处理后,IκBα蛋白水平升高的同时p65和IκBα的磷酸化水平也呈浓度梯度降低。PCR检测显示ILG作用于PSCs后,CCL2、CXCL1、CCL5、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA相对表达水平降低。将PSCs的细胞上清液处理RAW264.7,通过Western blot检测发现RAW264.7内IL-1β和CD86的表达升高,而TGF-β和Arg-1不受影响,ILG预处理后RAW264.7内IL-1β和CD86的表达水平也呈梯度降低,而TGF-β和Arg-1表达也同样不受影响。【结论】(1)ILG抑制巨噬细胞M1型极化,对M2型极化无显著影响;(2)ILG对NF-κB通路的抑制作用参与巨噬细胞M1型极化的调控;(3)ILG抑制PSCs内炎症因子及趋化因子的表达,在PSCs上清作用巨噬细胞后的M1型极化中发挥抑制作用。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R576
【图文】：

化学结构式

理学改变包括进行性纤维化和持续性的炎症，而其发究 CP 的病理生理机制，越来越多的动物模型也随即素（CCK）类似物，可诱导胰腺合成并大量分泌蛋白酶组织的炎症和损伤并逐步发生胰腺纤维化[7]。反复雨蛙越来越被广泛运用到多项研究中[34, 35]。因此，我们采。药甘草（Glycyrrhiza）的根茎中提取出的一种黄酮类化合在抗炎、抗氧化、抗癌、抗病毒及免疫调节等诸多方示，ILG 在 AP 动物模型中有保护作用[33]，而目前尚无道。因此，本章旨在通过体内实验观察 ILG 在 CP 动其他脏器存在影响。

流程图,小鼠,流程图,方式

图 1-2 小鼠造模方式及流程图素所需计量的计算：每周小鼠称重 1 次并记录，根据体重，ILG 40mg/kg，计算所需的各试剂的溶液体积。停止注射雨蛙素和灌胃，放置于新的饲养笼中正常进食饮况。标本取材和处理前，小鼠正常进食饮水 1 周，采用水合氯醛腹腔注射麻醉后采用断颈法处死小鼠。血液标本静置 30min 后，4℃，取上层血清，分装后放置-80℃ 冰箱保存。在动物解剖台找到胰腺，随后沿着胰腺体尾部向胰头部位进行分离。将分，第一部分（约 0.5g）放入装有 RNA later 的离心管中下部分浸入 4%多聚甲醛溶液中，于摇床上固定 24h 后更换放入 4℃冰箱中固定过夜，用于后续制作石蜡切片、HE

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