游离脂肪酸通过NLRP3介导致Kupffer细胞炎症反应的机制研究

发布时间：2020-06-18 05:01

【摘要】：目的：①探讨原位PBS灌注、胶原酶离体消化、梯度离心、选择性贴壁四步法分离Kupffer细胞（KCs）的效果。②证实NLRP3炎症小体在游离脂肪酸（FFA）激活KCs炎症反应中的作用。③阐述NLRP3在LPS激活KCs炎症反应中的可能作用。④初步明确FFA促进LPS激活KCs炎症反应，探讨FFA通过激活NLRP3调节IL-1表达的途径增加LPS激活KCs炎症反应作用的可能机制。 方法：①采用原位PBS灌注+胶原酶离体消化+梯度离心+选择性贴壁四步法分离KCs，根据具体步骤方法不同随机分为3组：无胶原酶原位灌注+PBS梯度离心组（改良A组）、无胶原酶原位灌注+Percoll细胞分离液密度梯度离心方法组（B组）、胶原酶原位灌注+Percoll细胞分离液密度梯度离心方法组（C组）。动态观察KCs的生存时间及形态变化，应用F4/80(BM8)标记KCs特异抗原，进行免疫细胞化学染色及免疫荧光检测鉴定KCs及判断纯度；吞墨试验了解KCs的吞噬功能，应用台盼蓝拒染试验判断细胞的活性，比较不同组别分离方法的KCs得率、活性及纯度。②首先分离小鼠KCs观察不同浓度的FFA对KCs炎症反应影响； KCs随机分为5组：Control组，加培养基、0.2mmol/L组、0.3mmol/L组、0.4mmol/L组、0.5mmol/L组；FFA刺激24h后， Western blot检测NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白表达，实时荧光定量PCR（real time qPCR）检测NLRP3、Caspase-1、ASC的mRNA表达， ELISA检测KCs培养上清液IL-1、IL-18的表达情况。其次了解在固定FFA浓度（0.35mmol/L）对KCs的炎症反应的时间-效应关系，KCs随机分5组，对照组加入培养基及相应量的BSA、4h组、8h组、12h组、24h组，分别给予0.35mmol/L的FFA刺激，检测KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及基因表达以及IL-1、IL-18的变化情况。最后KCs随机分为4组：Control组加培养基及相应量的BSA、FFA组、FFA+NLRP3siRNA组、FFA+Control shRNA组；shRNA转染KCs后8h通过荧光显微镜鉴定转染效果。FFA刺激24h后，检测KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及其基因表达和IL-1、IL-18的变化情况，分析NLRP3在FFA致KCs炎症反应中的作用。③首先探讨LPS致KCs炎症反应的量效关系，分离的KCs随机分为4组：Control组、LPS组（0.5ug/ml）、LPS（1ug/ml）组、LPS（2ug/ml）组，LPS刺激24h后，检测KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及其基因表达及IL-1、IL-18的表达情况。其次分离小鼠KCs随机分为4组：Control组、LPS组（1ug/ml）、LPS（1ug/ml）+shRNA组、LPS（1ug/ml）+Control siRNA组，LPS刺激24h，检测KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及其基因表达以及IL-1、IL-18的变化情况，分析NLRP3在LPS激活KCs炎症反应中的作用。(4)分离小鼠KCs随机分为6组：Control组、FFA组、LPS组、FFA+LPS组、FFA+LPS+shRNA组、FFA+LPS+Control shRNA组；检测KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及其基因表达以及IL-1、IL-18的表达情况，分析FFA对LPS激活KCs炎症反应的影响。 结果：①刚分离的KCs细胞近似类圆形，接种1h后，此时收获细胞纯度较高，但由于贴壁时间短，部分KCs未贴壁使细胞得率相对较低，KCs贴壁培养2h后细胞的得率及纯度相对较高。观察KCs形态见在荧光显微镜下328nm荧光未能激发KCs发出荧光，培养2天后，细胞充分伸展，表现形状多样性，可呈现星形或不规则形，培养KCs最长见存活4周。F4/80免疫细胞化学染色及免疫荧光行激光共聚焦显示分离的细胞为KCs；吞墨试验表现为KCs吞噬大量碳素颗粒，台盼蓝染色表现为正常KCs拒染，凋亡细胞表现为被染成蓝色，计数各组KCs的活性数目均在90%左右。综合得率、纯度及活性判断改良法原位PBS灌注+胶原酶离体消化+梯度离心+选择性贴壁四步法分离KCs与其它两组无明显差异（P＞0.05），是一种简便有效分离KCs的方法。②NLRP3shRNA质粒能够高效转染KCs，荧光显微镜下观察转染后8小时KCs转染效果可以达到85%。FFA刺激KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC表达明显升高，培养液的IL-1、IL-18表达水平明显升高（P＜0.001），同条件干预组内NLRP3、Caspase-1、ASC的表达趋势无明显差异（P＞0.05）。NLRP3基因沉默可以有效地抑制NLRP3、Caspase-1、ASC及IL-1、IL-18的表达（P＜0.001）。③LPS刺激后，KCs的IL-1、IL-18表达水平明显升高，但是NLRP3、Caspase-1、ASC的表达改变不明显（P＞0.05），NLRP3基因沉默，无明显抑制LPS激活KCs的IL-1、IL-18升高（P＞0.05）。④FFA明显增加了KCs对LPS的敏感性，促进LPS致的致KCs炎症反应，KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC以及IL-1、IL-18表达明显升高，致炎作用明显高于单独FFA或者LPS的作用（P＜0.001），NLRP3基因沉默可以有效地抑制NLRP3、Caspase-1、ASC的表达，细胞培养液中IL-1、IL-18的含量水平明显降低（P＜0.001）。 结论：①原位PBS灌注+离体胶原酶消化+梯度离心+选择性贴壁四步法分离法简化了KCs的提取分离，是一种有效、简便、经济的分离KCs的方法。②高浓度的FFA对KCs存在明显脂毒性，NLRP3炎症小体介导了FFA诱导的KCs的炎症反应，FFA通过激活KCs的NLRP3、ASC、Caspase-1表达促进分泌IL-1、IL-18炎症因子，而激发KCs在NASH中的炎症反应，阻断NLRP3信号通路可能是拮抗FFA促进NASH的新途径。③LPS能够明显激活KCs产生炎症反应分泌IL-1、IL-18，但是LPS致KCs炎症反应并不依赖于NLRP3通路。④FFA能够明显促进LPS激活KCs炎症反应，当shRNA抑制NLRP3后FFA促进LPS致KCs的炎症反应作用明显减弱，提示FFA可能依赖于NLRP3激活IL-1的途径促进LPS致KCs炎症反应，从而放大FFA脂毒性基础上的LPS激活KCs炎症反应作用，参与NASH的炎症反应。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575.5
【图文】：

图 2-1：载体图谱，目的基因片段导入载体示意图Fig. 2-1 profiles of pcDNA6.2 -GW/ EmGFP-miR 连接产物转化 100μl 感受态细胞 DH5α，涂 LB 平板（含 50μ37℃孵育。验证化平板分别挑取 3 个克隆，摇菌抽提质粒后进行测序（Invitro证重组克隆中插入片段序列是与设计的寡聚单链 NLRP3 DN 19-附图 22）。 NLRP3-shRNA 序列有效性的鉴定细胞 1 天按照上述改良方法提取 KCs 并用用含 10％胎牛血清

图 2-2：不同干预组 RT-qPCR 的扩增曲线图Fig. 2-2 The amplification curves of different groups

【共引文献】

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本文编号：2718739