肝星状细胞特异性启动子调控的真核表达载体的构建与鉴定

发布时间：2020-06-18 17:58

【摘要】：【目的】构建含有靶向活化肝星状细胞特异性启动子的质粒，并于体外检测其表达情况。 【方法】①利用聚合酶链式反应从PMIR-luciferase质粒中扩增得到目的基因——表达萤火虫荧光素酶基因片段即luciferease基因以及MCS多克隆位点+PloyA尾巴片段，通过双酶切将其连接克隆至含有α平滑肌肌动蛋白启动子（αSMA启动子）的Psmp8质粒载体中，构建Psmp8+Luciferase+MCS质粒，并进行酶切鉴定、基因测序证实。②利用胶原酶、链酶蛋白酶、DNA酶等灌注消化小鼠肝组织后，密度梯度离心法提取肝星状细胞（HSCs）；HSC培养传代自行活化后，进行针对αSMA的Westernblot及免疫荧光检测。③Psmp8+Luciferase+MCS质粒及海肾荧光素酶质粒按20:1比例混合后分别转染HSCs、小鼠肝细胞系AML12、小鼠库弗细胞系RAW264.7作为实验组，peGFP质粒及海肾荧光素质粒按20:1比例混合后分别转染HSC、AML12、RAW264.7作为对照组，48h后双荧光素酶报告基因检测法检测两质粒表达情况。 【结果】①Psmp8+Luciferase+MCS质粒经酶切及基因测序鉴定正确，成功构建了Psmp8+Luciferase质粒。②Western blot及免疫荧光检测示所提取细胞培养传代后可表达αSMA。③双荧光素酶报告基因检测显示Psmp8+Luciferase+MCS质粒中萤火虫荧光素酶基因可在活化HSCs中表达而不在AML12、RAW264.7中表达，对照组中无萤火虫荧光素酶基因表达。 【结论】Psmp8+Luciferase+MCS质粒所含αSMA启动子可靶向性在活化HSCs中表达，据此可以此质粒为载体构建靶向活化HSCs的质粒，进而用于基因治疗或其他实验研究。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575.2

【共引文献】

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本文编号：2719625