巨噬细胞免疫应答调控在急性肝损伤中的作用及机制研究

发布时间：2020-06-20 14:36

【摘要】：急性肝损伤是临床常见的急性肝脏疾病之一,其发病原因主要包括药物过量、毒性物质暴露、肝炎病毒感染以及手术所致的缺血再灌注损伤。严重的急性肝损伤可导致急性肝衰竭危及患者生命。虽然急性肝损伤的发病机制尚未阐明,但免疫炎性反应的激活在其中发挥了极其重要的作用。巨噬细胞作为肝脏内数量最多的先天免疫细胞是维持肝脏免疫平衡的重要因素。不同类型的损伤因素可激活巨噬细胞启动肝内免疫炎性反应,从而进一步加重肝脏损伤。因此如何调控巨噬细胞的促炎性反应是目前急性肝损伤研究的热点和难点。本课题旨在通过基因敲除和药物干扰两个手段分析和探究巨噬细胞功能的调控在两种不同类型的急性肝损伤中的作用及其机制。本课题的研究将为调控巨噬细胞的免疫炎性反应在治疗急性肝损伤中的应用提供新的思路和理论基础。课题分为以下两个部分:第一部分TGR5/Cat E信号通路调控巨噬细胞的迁移和极化在肝脏缺血再灌注损伤中的作用和机制研究研究背景:肝内的免疫炎性反应是肝脏缺血再灌注(ischemia/reperfusion,IR)损伤的主要原因之一,巨噬细胞介导的促炎性反应是其中重要的因素。许多研究表明G蛋白偶联胆汁酸受体(bile acid-responsive G-protein-coupled receptor,TGR5)在先天免疫调控中发挥重要的作用。我们课题组前期研究证实,TGR5能够抑制IR后的肝内炎性反应从而保护肝脏IR损伤,但是其具体的机制仍不清楚。研究目的:研究TGR5调控巨噬细胞的促炎性反应在肝脏IR损伤中的作用和机制。方法:我们采用野生型小鼠(wild type,WT)和TGR5基因敲除(TGR5~(-/-))小鼠构建骨髓移植嵌合体如下:WT→WT(髓系细胞和非髓系细胞均表达TGR5)、WT→TGR5~(-/-)(仅在髓系细胞表达TGR5)、TGR5~(-/-)→WT(仅在非髓系细胞表达TGR5),并建立小鼠肝脏IR损伤模型,研究TGR5在骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophages,BMDMs)中的激活对肝脏IR损伤的作用及其机制。利用基因芯片技术,分析了脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)激活后TGR5~(-/-)BMDMs和WT BMDMs之间的差异表达基因谱。将连续10位准备进行肝部分切除术需第一肝门阻断的患者随机分为口服熊去氧胆酸组(5人)和口服安慰剂组(5人),采取患者术前1h和术后24h的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)进行流式细胞术分析。结果:TGR5~(-/-)→WT嵌合体小鼠的肝脏IR损伤以及肝内的免疫炎性反应与WT→WT、WT→TGR5~(-/-)嵌合体小鼠相比明显加重。LPS体外活化TGR5~(-/-)BMDMs和WT BMDMs后,TGR5~(-/-)BMDMs迁移能力更强,并且更容易向促炎性巨噬细胞(M1)极化。TGR5激活剂INT-777在体内、体外均能明显增强TGR5的抑炎性效果。基因芯片检测LPS活化后的TGR5~(-/-)BMDMs和WT BMDMs的差异表达基因谱,结果显示TGR5~(-/-)BMDMs相比于WT BMDMs分泌细胞因子的能力和趋化性明显增强。组织蛋白酶E(cathepsin E,Cat E)是TGR5~(-/-)BMDMs中上调表达最明显的基因。利用siRNA干扰技术敲低TGR5~(-/-)BMDMs中Cat E的表达能够明显抑制TGR5~(-/-)BMDMs的迁移能力和M1极化。并且,体内巨噬细胞靶向性敲低Cat E同样能够减轻TGR5~(-/-)→WT嵌合体小鼠的肝脏IR损伤以及肝内的免疫炎性反应。肝门阻断患者PBMCs的流式细胞术结果显示,肝脏的IR明显激活了人外周巨噬细胞的TGR5表达,并且与巨噬细胞的抑炎性极化(M2)趋势相符。口服熊去氧胆酸促进了术前、术后人外周巨噬细胞TGR5的激活与M2极化。结论:TGR5能够抑制巨噬细胞的迁移能力和M1极化从而减轻IR后肝内的免疫炎性反应,在肝脏IR损伤中发挥保护作用。TGR5限制巨噬细胞促炎性反应的作用是通过抑制Cat E实现的。靶向TGR5/Cat E信号通路可能为治疗肝脏IR损伤提供新的治疗思路。第二部分精胺调控肝脏巨噬细胞的免疫应答在急性肝损伤中的作用及机制研究研究背景:肝脏内巨噬细胞(Kupffer cells,KCs)在毒性物质所致的急性肝损伤中发挥重要的作用。最新研究发现自噬在不同炎性环境下具有调控巨噬细胞M1/M2极化的功能。精胺是多胺的一种,具有抗氧化、抗衰老的作用。越来越多的研究表明精胺能够促进自噬在一些组织和细胞损伤中起到保护作用,但是其在急性肝损伤中的作用和机制尚不清楚。研究目的:探索精胺调控肝脏巨噬细胞介导的免疫炎性反应在硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)导致的急性肝损伤中的作用和机制。方法:采用腹腔注射TAA的方法建立小鼠急性肝损伤的模型。肝组织HE染色和免疫组化分别观察精胺预处理对TAA诱导的急性肝损伤以及对肝内炎性反应的影响。分离TAA处理后的肝脏KCs体外培养,在体外观察精胺对TAA诱导的KCs炎性反应的调控作用及其对KCs自噬的影响。体内、体外利用巨噬细胞靶向si RNA干扰技术探索精胺调控KCs自噬在TAA诱导的急性肝损伤中的作用。结果:精胺预处理能明显减轻TAA诱导的急性肝损伤,并且能明显抑制肝内炎性反应。分离TAA处理后小鼠肝脏KCs进行体外实验,发现TAA可诱导KCs向M1型极化,增强KCs的促炎性反应。精胺能抑制TAA刺激后的KCs向M1型极化而促进其向M2型极化,表现为M1型基因(IL-1β、i NOS)表达下调和M2型基因(Arg-1、Mrc-1)表达上调,以及KCs分泌的促炎性细胞因子(TNF-α、IL-6)减少而抑炎性细胞因子(IL-10)增多。精胺能够通过激活ATG5促进TAA刺激后KCs的自噬,表现为LC3B-II的蛋白水平增高,p62的蛋白水平降低,氯喹(chloroquine,CQ)能够显著阻断精胺诱导的KCs自噬流。体内、体外采用ATG5-si RNA干扰ATG5在KCs中的表达均能明显抑制精胺的抑炎性效果和对TAA诱导的急性肝损伤的保护作用。结论:在TAA诱导的急性肝损伤中,精胺可通过激活ATG5引发KCs的自噬从而抑制其向M1型极化而促进其向M2型极化,起到抑制肝内的炎性反应、减轻肝损伤的作用。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575
【图文】：

保护肝脏,髓系细胞,血清

24图 1.髓系细胞中 TGR5 的激活保护肝脏 IR 损伤。各组骨髓嵌合体小鼠建立肝脏IR 模型，于再灌注 6h 后收集血清和肝脏组织。A.血清 ALT 水平；B.血清 AST 水平；C.肝脏组织 HE 染色；D.Suzuki 评分；E.肝脏组织 TUNEL 染色；F.凋亡细胞计数。（*P<0.05）

髓系细胞,炎性反应,肝脏,巨噬细胞

1 髓系细胞中 TGR5 的激活减轻了肝脏 IR 后的炎性反应。各组骨髓嵌立肝脏 IR 模型，于再灌注 6h 后收集血清。A.PCR 检测肝脏组织中炎 TNF-α 、IL-6、CXCL-10、IL-10 基因表达水平。B.ELISA 检测血清 TNF-α 、IL-6、IL-10 的水平；脏损伤时肝内的巨噬细胞数量明显增加，主要原因是髓系单核细胞中趋化因子的作用下被募集到肝内的损伤部位，并且在局部微环境化而来。因此，我们利用免疫组化检测肝内的巨噬细胞数量的变化2A、B 所示，在肝脏 IR 后，肝内的 CD11b+巨噬细胞数量较 Sham 组明在 TGR5-/-→WT 组小鼠肝脏内 CD11b+巨噬细胞数量明显多于 WT→WTGR5-/-组。并且 INT-777 能有效地减少肝脏 IR 后 WT→WT 组和 WT→T的 CD11b+巨噬细胞数量，而对 TGR5-/-→WT 组无明显作用。

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