腺病毒介导的PUMA过表达对小鼠肝再生的影响

发布时间：2020-06-21 01:07

【摘要】： 促凋亡蛋白PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis)作为重要的p53靶分子,属于凋亡相关蛋白Bcl-2家族,是BH3-only亚族的重要成员,仅拥有一个BH3结构域,通过和其他家族成员的相互作用,发挥转导凋亡信号的功能,在凋亡信号通路中处于中心位置。此外,它在进化上极端保守,例如小鼠和人PUMA的基因同源性为91%,蛋白质同源性为90%;puma基因通过可变剪接能够产生多个转录本,其中有活性的产物主要是PUMA-α(23kDa)和PUMA-β(18kDa)。在生理状态下PUMA受到严格地调控,基础表达量较低;但在多种应激因素(如DNA损伤,缺氧,糖皮质激素及血清撤除等)刺激下,可通过p53依赖和非依赖两条途径被诱导,产生显著的促凋亡效应。由于肝再生过程中涉及到多个Bcl-2家族成员(如Bcl-2, Bcl-XL, Bax等)参与,但它们在肝再生早期的表达关系难以解释此时细胞凋亡罕见的现象;此外BH3-only亚族分子对肝再生的调控作用未知,因此我们选择了和已知的肝再生凋亡通路关系密切的PUMA作为研究的切入点,运用腺病毒介导的基因过表达技术,探讨它对肝再生早期的影响及其作用机制。本课题研究的主要内容是:1、肝再生早期PUMA及其相关基因的表达变化;2、腺病毒介导基因过表达模型的建立;3、过表达PUMA对肝再生的影响。首先,我们通过Western blotting、Real time PCR和免疫组织化学研究发现,PUMA在肝内围绕小叶中央静脉呈极性分布,其基础表达量较低;在肝再生早期(0h~72h)PUMA在mRNA和蛋白水平均发生显著下调,这种依赖转录的表达下调和转录抑制因子Slug的上调存在一定的相关性,而和p53在肝再生早期的上调无关;与其密切相关的Bcl-2家族成员Bcl-XL和Bax在蛋白水平均逐渐上调,并且Bax的变化与p53相关,然而凋亡效应酶Caspase 3却未见激活。为了解这些现象之间的内在联系,我们于是采用腺病毒介导的基因转移技术,通过尾静脉注射的方法使重组腺病毒Ad-PUMA和腺病毒空载体Ad-GFP感染C57小鼠肝脏,令外源基因在肝脏过表达,尔后进行部分肝脏切除术,检测术后24h再生肝细胞的增殖和凋亡情况。结果发现用高剂量(4×10~8 ifu)Ad-GFP感染小鼠,可以获得约30%的肝脏感染效率,并能在注射后3~8天维持外源基因的表达,对术后1~5天的再生肝重量无明显影响;而用极高剂量(1×10~9 ifu)和高剂量(4×10~8 ifu)Ad-PUMA注射小鼠会诱导急性肝衰竭,注射后48h死亡率分别为100%和35.7%,组织学检测显示肝细胞出现明显水肿、坏死,肝门部位严重出血和炎细胞侵润。低剂量(2×108 ifu)Ad-PUMA预处理后,术前未见小鼠急性期死亡,肝脏也无异常表现,但术后24h死亡率骤升至66.7%,解剖见残余肝脏肿胀明显,组织学检测Ad-PUMA的肝脏感染效率仅约10%;Western blotting检测术后24h PUMA较正常水平仅上调约1倍;PCNA和TUNEL染色表明再生肝细胞增殖减少,凋亡增多,并伴有明显的炎症改变;Ad-PUMA感染后能使Bcl-XL反应延迟并上调Bax水平。与此对照,Ad-GFP在相同剂量下并不会引起小鼠急性期死亡和明显的炎症反应,也不显著升高术后24h死亡率,同溶剂组(注射等体积PBS)比较亦无明显差异。因此我们认为腺病毒介导的基因转移技术可以高效地使外源基因在肝脏表达,并且腺病毒载体本身在当前的剂量下不会产生显著的肝脏毒性,经Ad-GFP注射后小鼠的手术耐受性好,腺病毒载体并不影响再生肝的重量,不会干扰肝再生的总体进程。而PUMA的轻度过表达即可影响早期肝再生进程,引起明显的肝脏病理改变,说明它的下调对肝再生具有非常积极的意义,这可能是术后残余肝细胞在再生早期抵御凋亡的机制之一。其生理意义在于:通过调节PUMA的表达水平来发挥肝细胞的自我保护作用,降低肝细胞对外界不良刺激的敏感性,提高对凋亡的反应阈值,有利于肝细胞进入增殖周期。其作用机制可能包括在Slug调节下转录受抑,从而和Bcl-XL协同性调整表达水平,避免激活Bax以阻碍细胞凋亡;此外它的下调还可以解除对肝细胞增殖抑制,减少肝细胞坏死和降低炎症反应程度。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R575
【图文】：

肝再生,军医大学,硕士学位论文,号外

军医大学硕士学位论文三、实验结果（一）肝再生早期 PUMA 的表达情况1、PUMA 的 mRNA 水平变化首先在 mRNA 水平观察了小鼠经部分肝切术组（PH）和假手术组（SH）处ma 基因在肝再生早期（0h~72h）的变化情况，为此我们根据 PUMA-α 和 PUM剪接特点，跨过它们共有的 3 号和 4 号外显子设计引物，以检测总 PUMA mR表达水平。通过 Real time PCR，我们发现在 PH 组，puma mRNA 自 PH 后急，至术后 24h 至最低点，约为 0h 的 1/5，此后也一直处于低水平；而在 SH 组后 6h 内也同样下调，但这种改变是一过性的，自 12h 起开始回升，此后便回础水平（图 1.1）。

肝再生,基础水平,转录本,过表达

腺病毒介导的 PUMA 过表达对小鼠肝再生2、PUMA 的蛋白水平变化进一步地，我们采用 Western blotting 方法观察 PUMA 蛋白在肝再生早期，以了解同 mRNA 水平的变化是否同步，从而探究 PUMA 在肝再生早期录水平的调节。在 PH 组，PUMA 的 2 个转录本（PUMA-α 和 PUMA-β 6h 起逐渐下调，此后一直维持在较低水平；而在 SH 组 PUMA-α 的变化PUMA-β 在术后 12h 一过性下调后即恢复到基础水平（图 1.2）。

【共引文献】