P2X7R调控肝星状细胞—巨噬细胞交叉对话的机制研究

发布时间：2020-06-22 06:09

【摘要】：目的:研究通过嘌呤能离子通道型7受体(purinergic receptor P2X,ligand-gated ion channel 7,P2X7R)通路改善肝星状细胞活化导致的肝纤维化的作用及重要性;探究P2X7R、Toll样受体-4(toll like receptor-4,TLR4)、核苷酸结合寡聚化结构式受体 3(NLR family,pyrin domain containing 3,NLRP3)三者轴线的在肝纤维化中的作用,为肝纤维化治疗靶点提供有效的实验依据。方法:体外实验选用人肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)系LX-2细胞,在给与P2X7R选择性抑制剂A438079、TLR4抑制剂CLI-095、caspase-1特异性抑制剂Ac-YVAD-cmk预处理一个小时后,用转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)刺激24 h,提取相应细胞总蛋白和RNA,通过蛋白免疫印迹实验、PCR技术以及免疫荧光染色实验来测定人肝星状细胞LX-2细胞活化过程中纤维化指标α-平滑肌细胞肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)以及Ⅰ型胶原蛋白(collagen type Ⅰ,collagen Ⅰ)的表达;为进一步证明P2X7R在肝纤维化中发挥的作用,用 CMV(Cytomegalovirus,pronounced sy-toe-MEG-a-low-vy-rus)质粒或CMV-P2X7R质粒对LX-2细胞进行转染,使P2X7R表达增加后给与TGF-β刺激24 h,检测细胞中相应肝纤维化指标标志蛋白collagen Ⅰ和α-SMA的mRNA和蛋白表达情况,并用免疫荧光染色实验进行验证;用佛波脂(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导分化人急性白血病单核细胞(human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)作为巨噬细胞,将脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)或脂多糖联合腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)刺激巨噬细胞所得的上清液作为条件培养基间接刺激人肝星状细胞的组别与LPS或LPS联合ATP直接刺激人肝星状细胞的组别进行比较,采用蛋白免疫印迹实验、PCR技术和免疫荧光染色实验检测肝纤维化相关标志collagen Ⅰ和α-SMA的表达;PMA诱导分化THP-1细胞成为巨噬细胞后用P2X7R选择性抑制剂A438079、TLR4抑制剂CLI-095、caspase-1特异性抑制剂Ac-YVAD-cmk预处理一小时,再用LPS刺激4 h,收细胞前30 min给与ATP刺激,收集到的上清液通过Elisa检测细胞外炎症相关因子白细胞介素-1β(interleukin-lβ,IL-1β)的表达情况;人肝星状细胞用上述收集的上清液作为条件培养基刺激24 h,通过蛋白免疫印迹、PCR技术和免疫荧光染色实验检测肝纤维化相关指标collagen Ⅰ和α-SMA的表达;结果:P2X7R选择性抑制剂-A438079、TLR4抑制剂-CLI-095、caspase-1特异性抑制剂-Ac-YVAD-cmk能够降低TGF-β激活的人肝星状细胞中纤维化指标α-S1MA、collagen Ⅰ的表达;P2X7R过表达与TGF-β共同刺激的LX-2细胞α-SMA、collagen Ⅰ的表达增加;条件培养基间接刺激LX-2细胞的组别与直接用LPS或LPS联合ATP刺激LX-2细胞的组别相比,条件培养基间接刺激LX-2细胞的组别肝纤维化相关指标collagen Ⅰ、α-SMA的表达升高;经LPS与ATP联合作用于巨噬细胞所得的上清液中IL-1β的表达升高,A438079、CLI-095、Ac-YVAD-cmk预处理的组别表达降低;LX-2细胞经LPS与ATP联合刺激巨噬细胞所得的上清液处理,肝纤维化相关各项指标collagen Ⅰ、α-SMA表达升高,而巨噬细胞预处理A438079、CLI-095、Ac-YVAD-cmk所得上清液刺激LX-2细胞可以有效的降低上述相关因子的表达;结论:P2X7R的激活促进TGF-β诱导的肝星状细胞的活化,P2X7R/TLR4/NLRP3轴线可调控TGF-β所激活肝星状细胞的活化,LPS活化的巨噬细胞释放的细胞外炎症因子IL-1β对肝星状细胞向纤维化发展有促进作用,而P2X7R/TLR4/NLRP3轴线可调控肝纤维化中巨噬细胞与肝星状细胞的交叉对话。
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.2
【图文】：

图３－１．邋Ｐ２Ｘ７Ｒ／ＴＬＲ４／ＮＬＲＰ３通路对ＴＧＦ－Ｐ所激活的肝星状细胞的影响。（Ａ）相应抑制剂逡逑预处理ＬＸ－２细胞１小时，给与ＴＧＦ－Ｐ刺激２４小时，蛋白免疫印迹实验ａ－ＳＭＡ与ｃｏｌｌａｇｅｎ邋Ｉ逡逑的蛋白表达结果。（Ｂ）相应抑制剂预处理ＬＸ－２细胞１小时，给与ＴＧＦ－Ｊ３刺激２４小时，逡逑蛋白免疫印迹实验ａ－ＳＭＡ与ｃｏｌｌａｇｅｎ邋Ｉ的ｍＲＮＡ表达结果。＃Ｐ＜０．０５，邋＃＃＃Ｐ＜０．００１，与正常逡逑组相比；＊Ｐ＜０．０５，邋＊＊Ｐ＜０．０１，邋＊＊＊Ｐ＜０．００１，与邋ＴＧＦ－Ｐ邋刺激组相比。逡逑

２Ｃ的结果来看，当ＴＧＦ－ｐ刺激和Ｐ２Ｘ７Ｒ激活的双重作用下ｃｏｌｌａｇｅｎ邋Ｉ逡逑和ａ－ＳＭＡ的蛋白及ｍＲＮＡ的表达要比单一作用下的表达要明显增多，免疫焚光逡逑染色实验（图３Ａ，３Ｂ）也验证了以上的结果。提示Ｐ２Ｘ７Ｒ在肝纤维化方面潜在逡逑的作用，Ｐ２Ｘ７Ｒ的激活促进了邋ＴＧＦ－Ｐ诱导的肝星状细胞的活化。逡逑１２逡逑

【参考文献】

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本文编号：2725308