【摘要】：第一部分乙型肝炎病毒X蛋白能过MEK/ERK和PI-3K/Akt信号通路上调cyclinD1并促进肝脏卵圆细胞增殖 第一节HBX在体外对肝脏卵圆细胞增殖的直接促进作用 目的：研究乙型肝炎病毒编码X蛋白在体外对肝脏卵圆细胞增殖的促进作用. 方法：运用荧光显微镜观察及Western blot对稳定表达HBX的大鼠肝脏卵圆细胞系HBX-EGFP-LE/6进行鉴定。以转染HBX细胞系HBX-EGFP-LE/6为实验组,转染标记绿色荧光蛋白空载体EGFP-LE/6、LE/6细胞系为对照组,通过MTT细胞增殖活力实验及EDU掺入实验比较三组细胞DNA合成速度。 结果：HBX在部分细胞克隆稳定高表达,对照组细胞未检测到HBX表达。HBX对肝脏卵圆细胞的增殖具有促进作用,在同步化后培养24h、48h、72h,与对照组相比,HBX-EGFP-LE/6卵圆细胞系增殖加快,差异有统计学意义(p0.01)。在血清刺激后,与对照组相比,HBX-EGFP-LE/6卵圆细胞系DNA合成加快,差异有统计学意义(p0.01)。 结论：细胞内稳定转染并表达的HBX蛋白对体外培养的肝脏卵圆细胞的增殖具有直接促进作用,并且促进其S期DNA合成。 第二节HBX对卵圆细胞周期蛋白表达的调控作用 目的：研究HBX对肝脏卵圆细胞中细胞周期调控蛋白表达水平的影响,探讨HBX促进肝脏卵圆细胞增殖的分子基础。 方法：稳定表达HBX基因的肝脏卵圆细胞克隆为实验组,表达绿色荧光蛋白的空载体组和LE/6卵圆细胞为对照组。Western blot检测细胞周期调控蛋白cyclinD1、CDK2、CDK4、p21、p27的表达水平 结果：与对照组相比,cyclinD1的蛋白表达水平在HBX-EGFP-LE/6细胞中显著上调,p27蛋白的表达轻微下调。 结论：HBX在肝脏卵圆细胞中影响细胞周期相关基因的蛋白表达水平,可能是其促进肝脏卵圆细胞增殖的分子基础之一。 第三节HBX对肝卵圆细胞MAPK信号及AKT信号的影响 目的：研究HBX在卵圆细胞LE/6中对MAPK通路信号的影响,探讨HBX促进LE/6卵圆细胞增殖的分子机制。 方法：稳定表达HBX基因的HBX-EGFP-LE/6肝脏卵圆细胞为实验组,表达绿色荧光蛋白的空载体组和LE/6卵圆细胞为对照组；Western blot检测了ERK、AKT、JNK、p38、p-ERK、pAKT、p-JNK、p-p38在对照组与实验组卵圆细胞内的表达水平。 结果：与对照组比较,在HBX-EGFP-LE/6中,p-ERk、p-Akt的表达水平升高。但ERK、Akt、JNK、p38、p-p38、p-JNK在三种细胞中的蛋白表达水平没有明显变化。 结论：胞内稳定表达的HBX蛋白可以在体外培养的肝脏卵圆细胞中上调ERK、AKT信号。 第四节HBX上调cyclinD1表达并促进肝脏卵圆细胞增殖依赖于HBX上调的ERK及AKT信号 目的：研究HBX促进卵圆细胞增殖及上调cyclinD1是否依赖于HBX-EGFP-LE/6内上调的ERK和／或AKT信号 方法：稳定表达HBX基因的HBX-EGFP-LE/6肝脏卵圆细胞为实验组,表达绿色荧光蛋白的空载体组和LE/6卵圆细胞为对照组；运用特异性信号通路抑制剂LY294002,PD184352阻断卵圆细胞MEK/ERK及PI-3K/Akt信号转导,然后在指定时间点westernblot检测cyclinD1在各组细胞中的表达情况；MTT检测阻断干预72h后各组细胞的增殖活性。 结果：抑制剂PD184352阻断通路72h后,干预组HBX-EGFP-LE/6细胞较未干预组细胞增殖活性降低,差异有统计学意义(p0.01)。抑制剂PD184352阻断通路72h后,干预组HBX-EGFP-LE/6细胞较未干预组细胞增殖活性降低,差异有统计学意义(p0.01). HBX-EGFP-LE/6细胞中的CyclinD1蛋白高表达水平在两种抑制剂分别作用后均不能维持。 结论：HBX上调的卵圆细胞增殖活性和CyclinD1表达水平,依赖于HBX上调的ERK及AKT信号。 第二部分乙型肝炎病毒X蛋白通过影响TGFβ/smad通路影响肝脏卵圆细胞增殖 第一节HBX降低肝脏卵圆细胞对TGFβ1增殖抑制效应敏感性 目的：研究卵圆细胞中HBX蛋白对TGFβ1增殖抑制效应的影响。方法：HBX-EGFP-LE/6卵圆细胞作为实验组, LE/6和EGFP-LE/6卵圆细胞作为对照组。运用Real-time和estern blot检测三组卵圆细胞中TGFβ受体2mRNA及蛋白表达水平。MTT试验比较外源性TGFβ1在三组卵圆细胞中的增殖抑制效应。结果：TGFβ受体2在HBX-EGFP-LE/6中的mRNA及蛋白表达水平均下调。MTT表明外源性TGFβ1在对照组细胞中具有更强的增殖抑制效应,差异有统计学意义(p0.01)。结论：HBX影响卵圆细胞对TGFβ1增殖抑制效应的敏感度,可能与TGFβ受体2的基因表达水平下调有关。 第二节乙型肝炎病毒X蛋白对卵圆细胞中smad2、smad3、smad4基因表达的调控作用 目的：研究乙型肝炎病毒编码X蛋白HBX对肝脏卵圆细胞中TGFβ/smad中核心元件samd2、samd3、samd4表达的调控作用。 方法：稳定转染HBX基因的大鼠卵圆细胞株HBX-EGFP-LE/6作为实验组,转染绿色荧光蛋白标记空载体的大鼠卵圆细胞株EGFP-LE/6,大鼠卵圆细胞株LE/6作为对照组检测TGF(3/smad信号通路中的核心元件smad2、smad3、samd4的表达情况。Real-time PCR检测转染细胞系HBX-EGFP-LE/6,以及对照组EGFP-LE/6, LE/6中smad2、smad3、smad4的mRNA表达水平,western blot检测三组细胞中smad2、smad3、smad4蛋白表达情况。 结果：与对照组相比,稳定转染HBX基因的大鼠卵圆细胞株HBX-EGFP-LE/6中smad2的mRNA及蛋白表达水平未有显著变化。smad3、smad4的mRNA表达水平有显著降低(p0.05), Smad3蛋白表达水平有一定程度降低,smad4蛋白表达水平没有显著变化。 结论：乙型肝炎病毒编码X蛋白可以在卵圆细胞中影响TGFβ/smad信号通路中的核心元件smad3的转录及蛋白合成,对samd4的转录有一定影响,对smad2的表达没有显著作用。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R512.62
【共引文献】
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