人外周血单个核细胞体外向肝样细胞诱导分化的研究

发布时间：2020-06-23 02:19

【摘要】：治疗终末期肝病所致的肝功能衰竭是临床治疗的一大难题,目前除了改善临床症状外没有较为有效的治疗手段,尤其是无法再生损伤、死亡的肝脏细胞,这使得肝移植可能成为目前一种可恢复肝脏功能的治疗方法,然而因其供体短缺、免疫排斥、治疗费用较高等原因,临床应用难以推广。现在随着细胞生物技术和分子生物学技术的发展,以及对干细胞研究的深入,通过干细胞移植治疗慢性肝病越来越受到国内外专家的重视。干细胞是一类具有无限自我增殖更新能力的多潜能细胞,在特定的条件下具有定向诱导分化的潜能,如在特定的条件下,干细胞能够向内胚层的肝脏细胞分化。因此,干细胞再生技术为肝病的治疗提供了一种新的研究方向。目的:本课题组已在前期研究工作中证明大鼠周围血干细胞在一定条件下可以诱导分化为肝样细胞。此次本实验研究经rhG-CSF动员后肝硬化患者外周血单个核细胞(PBMCs)中CD34+细胞的含量,以及PBMCs在HGF、FGF-4诱导因子的作用下能否向肝脏样细胞转分化,证实外周血干细胞的可塑性,进一步为临床上探索外周血干细胞移植治疗肝病提供理论依据。方法: 1.用血细胞分离机采集经G-CSF动员后肝硬化患者的外周血单个核细胞,并通过流式细胞仪检测CD34的含量。 2.密度梯度离心法分离纯化单个核细胞。用RPMI1640培养液培养外周血单个核细胞,并洗涤未贴壁细胞,进一步出去杂细胞,使之纯化。 3.用含10%胎牛血清、M-CSF、IL-3、β-巯基乙醇的RPMI1640培养液培养贴壁细胞6天,每2天换液1次。 4. 6天后半量换液,加入含有10%胎牛血清、HGF、FGF-4的RPMI1640培养液对贴壁细胞诱导,每2天半量换液1次并继续培养到第20天。 5.在培养过程中观察细胞形态学的变化,免疫荧光法检测第6、14、20天肝细胞标志物AFP、CK18的表达情况。 6.对于诱导后7天、14天细胞Western Blot检测肝细胞特异性表达。结果: 1.血细胞分离机分离出的外周血中单个核细胞数≥109/kg,CD34+含量为0.4%。 2.分离出的细胞呈圆形,台盼兰染色检测细胞活率95%,培养2小时后,培养液洗涤去除未贴壁细胞,贴壁细胞呈现小圆形,大小均匀,透明度大。 3.在M-CSF、IL-3培养基中培养贴壁细胞6天后,可观察到细胞呈圆形,集落成群生长,细胞趋向融合。在未给予增殖因子的对照组中,细胞大部分呈现梭形伸展,单个生长。 4.经HGF、FGF-4诱导7天后,可见细胞一部分呈现多边形,体积变大;诱导14天后,细胞总体数量减少,多边形细胞比例增多。未加诱导因子的对照组,细胞呈梭形生长,大部分细胞贴壁伸展。 5.对诱导后第14、20天的细胞用免疫荧光法检测AFP、CK18的表达,荧光显微镜下显示结果均为阳性。对照组以及加入诱导因子前AFP和CK18的表达为阴性。 6.诱导7天、14天的细胞经Western Blot检测到肝细胞特异性表达。结论:外周血单个核细胞在一定的条件下具有向肝脏样细胞分化的潜能,并可能代替骨髓间充质干细胞移植治疗肝病。 1.动员后肝硬化患者外周血单个核细胞,体外在一定诱导培养条件下可转分化为肝样细胞。 2.转分化的肝样细胞可有AFP、ALB、CK-18的表达,其中,ALB、CK-18表达强度与培养时间成正比,而AFP成反比。 3.未进行诱导培养的单个核细胞很少转分化为肝样细胞。 4.外周血单个核细胞转分化为有肝细胞功能的同时,有细胞形态学改变,近似于肝细胞。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575.3
【图文】：

贴壁细胞,相差显微镜,细胞,活细胞率

（二）B 组未加任何增殖诱导因子培养：新鲜分离的外周血单个核细胞为透形，大小均一，折光性较强，台盼兰染色测定活细胞率>95%，培养 4-6 小时上清，弃去未贴壁细胞后可见贴壁细胞，呈圆形、类圆形。培养 7 天后细胞个生长未见集落，部分细胞逐渐伸展呈梭形生长。14 天后细胞大部分呈纤维样部分仍类圆形。见图 3。图 3：新鲜分离的 PBMCs 图 3：培养第 7 天的 PBMCs倒置相差显微镜（x10）倒置相差显微镜（x10）

贴壁细胞,细胞,活细胞率,诱导因子

图 2：L02 肝脏细胞倒置相差显微镜（x20）（二）B 组未加任何增殖诱导因子培养：新鲜分离的外周血单个核细胞为透形，大小均一，折光性较强，台盼兰染色测定活细胞率>95%，培养 4-6 小时上清，弃去未贴壁细胞后可见贴壁细胞，呈圆形、类圆形。培养 7 天后细胞个生长未见集落，部分细胞逐渐伸展呈梭形生长。14 天后细胞大部分呈纤维样部分仍类圆形。见图 3。

【参考文献】