【摘要】： 慢性肝脏疾病是一类世界性的严重危害人类健康的主要疾病,其中肝纤维化是这个过程的中间及关键环节。肝纤维化(hepatic fibrosis)是慢性肝病的共同病理学基础,是形成肝硬化的必经病理阶段,其特征是以胶原为主的细胞外间质(extracellular matrix,ECM)成分合成增多和/或降解相对不足而在肝内过量沉积。尽管不同肝病的发病机制有所不同,但其发生纤维化的最终途径相似,其中最关键的环节是肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)的激活。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是启动整个事件的开端,在肝纤维化过程中扮演着重要的角色,诱导活化HSC的凋亡可使肝纤维化发生逆转。越来越多的研究认为HSC活化和增殖与其凋亡受到抑制有关,而核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)与细胞凋亡关系密切。NF-κB是一种能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子κB序列特异合的蛋白因子,由Rel蛋白家族的成员以同源或异源二聚体形式组成,目前发现的哺乳动物的Rel蛋白包括p65 (RelA, NF-κB3)、p50 (NF-κB1)、Rel (c-Rel)、RelB和p52 (NF-κB2),其中p65/p50是发现最早的,分布最广泛,主要发挥生理作用的NF-κB。NF-κB能与多种细胞基因启动子或增强子序列特定位点发生特异性结合而促进转录和表达,与炎症反应、免疫应答以及细胞的增生、转化和凋亡等重要的病理生理过程密切相关。诱导活化HSC的凋亡可使肝纤维化发生逆转。 双环醇是中国医学科学院药物研究所研制的抗肝炎新药,其化学名称为6一甲氧羰基_l5一羟甲基一2,3,2 ,3一双亚甲二氧基4,4一二甲氧基联苯。以往研究表明,双环醇对多种实验性急、慢性肝损伤均有明显保护作用。临床用于治疗慢性乙型、丙型病毒性肝炎已取得较好疗效,且具有口服吸收好、不良反应少的特点,除此之外,双环醇还可使肝纤维化大鼠血清ALT、AST、总胆红素、透明质酸(HA)和Ⅲ型前胶原肽(PⅢP)水平明显降低,白蛋白水平显著增高.提示我们双环醇可能通过下调HSC内NF-κB的基因表达,从而使HSC的凋亡增加,减缓肝纤维化的进程。本文的主要目的是研究双环醇对实验性HSC是否具有抗凋亡作用,从而为扩大双环醇临床应用提供理论依据。 目的:本实验通过设计用不同浓度的双环醇对体外培养的肝星状细胞的作用,研究其对肿瘤坏死因子-a(TNF-a)激活的肝星状细胞增殖与凋亡的影响。 方法:体外培养大鼠肝星状细胞,进行以下分组:按下列分组进行处理:①对照组;②TNFá组;③双环醇组④TNF-a+双环醇。 应用电泳迁移率改变实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)测定NF-κB活性变化;免疫荧光染色法(抗大鼠Cy3)测定NF-κB在HSCs中的分布;反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测基质金属蛋白酶抑制因子-1(Timp-1)的mRNA的表达;MTT方法测定HSCs增殖率;末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末段标记法(terminal deoxynucleotidy1 transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)检测细胞凋亡的变化。 结果: 1.EMSA显示对照组即可检测出较高的NF-κB结合活性,TNF-a刺激后,NF-κB结合活性升高明显(P0.01);双环醇干预后,双环醇组的NF-κB结合活性明显下降(P0.01);TNF-a +双环醇组亦可检测出较高的NF-κB结合活性,与TNF-a组比较无明显减低,(P0.05). 2.免疫细胞荧光染色法显示:对照组及TNF-a组NF-κB阳性细胞较多,细胞形态正常,且在荧光显微镜下可以观察到红色的荧光,TNF-a组观察到红色的荧光强度高于对照组;双环醇组阳性细胞减少,并出现浓染致密的凋亡细胞。 3.反转录聚合酶链反应显示:0.5mmol/L双环醇组的HSC Timp1的mRNA表达减低,较TNF-a组显著减低(P0.01),与对照组及TNF-a +双环醇组比较均减低,表明经0.5mmol·L-双环醇干预后Timp1的mRNA表达减低。 4.MTT方法测定显示,与对照组相比TNF-a组在24h,48h和72h都有明显差异,双环醇组在48h(P0.05)有明显差异。与TNF-a组相比双环醇组在24h,48h和72h都有明显差异,TNF-a和双环醇合用组在24h,48h和72h亦有明显差异。 5.双环醇作用后的TNF-a激活的HSC凋亡增加:TUNEL法结果显示24h,48h,72h三组0.5mmol·L双环醇组细胞凋亡较TNF-a组增加(P0.01),而48h,72h两组之间的凋亡率无明显差异(P0.05)。 结论: 1.体外细胞培养研究表明,TNF-a可以刺激HSCs增殖并促进NF-κB蛋白含量及结合活性的表达;双环醇对NF-κB蛋白表达和结合活性有抑制作用。 2.双环醇可以抑制TNF-a刺激的HSCs增殖并诱导其凋亡。 3 .双环醇可促进HSC的凋亡,同时Timp1合成减少,有利于抗肝纤维化作用。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R575.2
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本文编号：
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