水甘油通道蛋白7、9在非酒精性脂肪肝病中治疗与预防作用的研究

发布时间：2020-06-24 17:16

【摘要】：目的：构建pEGFP-N1-AQP7、pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9重组质粒,验证其在COS-7细胞中的表达情况,检测其对L-02细胞AQP9表达的影响及其对L-02细胞脂肪变性的的作用,利用电穿孔的方法将重组质粒转化进入减毒沙门氏菌构建重组SL7207疫苗株,为AQP7及AQP9在非酒精性脂肪肝病的基因治疗奠定基础。 方法：(1)从人脂肪组织及肝脏组织中提取总RNA,通过RT-PCR获得AQP7及AQP9基因,将其克隆到pEGFP-N1质粒上,构建重组质粒pEGFP-N1-AQP7及pEGFP-N1-AQP9,将其转染COS-7真核表达细胞,通过观察绿色荧光蛋白的表达、]RT-PCR和Western blot检测其在COS-7中的表达；(2)构建针对人AQP9的干扰质粒pshRNA-AQP9,将其转染L-02肝细胞,通过RT-PCR和Western blot检测其抑制效率；(3)将pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9分别转染油酸诱导脂肪变性的L-02细胞,检测其对L-02细胞脂肪变性的作用；(4)通过电穿孔的方法将pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9转化减毒沙门氏菌SL7207并检验其表达情况和稳定性。 结果：(1)通过RT-PCR获得AQP7及AQP9基因片断,成功构建重组质粒pEGFP-N1-AQP7及pEGFP-N1-AQP9,验证了其在COS-7细胞中表达并与绿色荧光蛋白融合；(2)成功构建pshRNA-AQP9,并筛选出对L-02细胞AQP9干扰效果明显的重组质粒；(3)成功建立L-02细胞脂肪变性模型,pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9对其脂肪变性程度分别有加重及减轻作用；(4)成功构建重组SL7207疫苗株SL7207/pEGFP-N1-AQP9及SL7207/pshRNA-AQP9。 结论：通过油酸诱导建立L-02肝细胞脂肪变性模型,转染pEGFP-N1-AQP9上调其AQP9的表达可使其脂肪变性程度加重,反之,转染pshRNA-AQP9下调其AQP9表达能使其脂肪变性程度减轻,表明AQP9在L-02细胞脂肪变性中起重要作用。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575.5
【图文】：

脂肪组织及肝脏组织总RNAI%琼脂糖凝胶电泳

155脂肪组织总RNA肝脏组织总RNA图1一1脂肪组织及肝脏组织总RNAI%琼脂糖凝胶电泳Figurel一 1TOtalRNAI%agarosegelelcctrol)horesisofadil)osetissueandlivertissue2.2RT一PCR扩增目的基因将Rl，~pCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，在 1O29bp及在888bp附近有特异性条带，与实验设计相一致，提示扩增产物为AQP7片段及AQPg片段，见图卜2。231029饰673bP888卜P678卜P AQP7PCR产物图1一ZAQP7及AQPgPCR产物 AQPgPCR产物2%琼脂糖凝胶电泳Figurcl一 2The20/0agarosegelelectroPhorcsisofAQP7andAQPgPCRI)roduetion DNAMa人er(DLZ()()());2.3:RT~pCR产物 DNAMaker(DL2000);2.3;Rl’ -PCRProductlon2

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本文编号：2728156