骨髓间充质干细胞在治疗大鼠慢性胰腺炎中的作用

发布时间：2020-06-24 20:21

【摘要】：研究背景慢性胰腺炎(Chronic pancreatitis, CP)是公认的临床难治性疾病,胰腺实质发生慢性持续性炎性损害和纤维化是其主要病理特征,其确切的发病机制至今尚未阐明。目前CP的临床治疗手段效果均不够理想,即使去除致病因素后胰腺组织纤维化进程仍然呈不可逆性地发展,而持续存在的纤维化病变是潜在的致癌因素。因此,寻求安全、有效的治疗方法减轻或逆转慢性胰腺炎中胰腺实质的渐进性纤维化,并改善胰腺功能对提高慢性胰腺炎患者生存期和生活质量具有重要意义。以干细胞移植为代表的现代组织工程学和以转基因为代表的现代基因工程技术为多种疑难疾病的治疗提供了一个全新的探索领域。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一类具有多向分化潜能和高度自我更新能力的成体干细胞,具有来源丰富、易于分离培养和扩增、可长期存活、基因转染效率高、转染后稳定表达、低免疫原性等其它干细胞不可比拟的优点。 MSCs移植治疗疾病已成为研究的热点。研究表明MSCs对心、肝、肺、肾、神经系统等多种器官的病理损伤有保护和修复作用。但目前有关MSCs在胰腺疾病方面的研究较少,国内李兆申教授研究表明骨髓间充质干细胞可能参与急性胰腺炎组织损伤和修复,崔慧斐等通过移植骨髓间充质干细胞或注射粒细胞集落刺激因子(GCSF)的方法治疗L-精氨酸诱导的重症急性胰腺炎(SAP),提示骨髓间充质干细胞有助于减轻SAP的病情。目的探讨MSCs在慢性胰腺炎治疗中的作用机制以及对于慢性胰腺炎治疗的价值。对象与方法 1.对象是购自郑州大学动物中心的SD大鼠,其中80只随机分为对照组20只,模型组20只,假治疗组20只,治疗组20只。 2. BMSCs分离、培养、鉴定参考有关文献,采用改良的贴壁筛选法,至80%-90%细胞融合铺满单层培养瓶底时用0.25%胰酶消化传代培养。传至第5代时用0.25%胰酶消化,用PBS制成浓度为2×109/L的悬液,将细胞悬液分装至2只5ml试管中,分别加入小鼠抗大鼠CD29, CD44, CD45单克隆抗体及其同型对照做流式细胞术检测鉴定, rAAV2-EGFP介导的转染第四代BMSCs90%铺满瓶底后,0.25%胰酶消化,调节细胞浓度为5×104/L,接种于6孔板中,置于5%C02,37℃培养箱中。当细胞达到90%融合时按1：2传代培养。 3.取250g健康雄性SD大鼠80只,随机分为空白组,模型组,假治疗组和治疗组,在慢性胰腺炎模型复制8周时,向治疗组大鼠分别在20d,40d,60d各注射数量级为3×106/L,带有绿色荧光蛋白标记的BMSCs (GFP-BMSCs) 1 ml,空白组和假治疗组大鼠各注射等量无菌蒸馏水,模型组不予处理,在80d后取大鼠胰腺,部分制作切片,MASSON染色及免疫组化染色以检测PSC活化,增殖及分化情况,部分检测大鼠胰腺组织中I、III型胶原含量,IL-1,IL-6, IL-8, IL-10,TNF-α, TGF-β表达水平。 4.检测指标评价胰腺病变程度：①炎性细胞浸润程度②坏死程度：③结构破坏④有无黏液水肿⑤有无萎缩评价纤维化程度；检测胰腺组织中炎性因子的表达水平。 5.统计学方法均数之间的差异应用单向方差分析,数据以均数±标准差(χ±s)表示,采用SPSS16.0统计软件分析,P0.05为差异的显著性意义。结果 1.模型组1d后胰腺组织出现水肿,中性粒细胞浸润；7d后炎症逐渐加重,胰腺组织可见炎性细胞广泛浸润；14d后胰腺组织出现广泛的炎症细胞浸润以及轻度纤维化；28d时胰腺组织纤维化进展性加重,可见大量胶原沉积；60d后病理显示胰腺小叶结构破坏,广泛的炎性细胞浸润,间质纤维化比较严重。假治疗组和模型组病理表现大致相同。治疗组炎症细胞浸润状况减轻,胶原沉积面积减小,间质纤维化状况有所改盖空白组期间未见明显变化。 2.治疗组中desmin、GFAP、α-SMA表达,组织中Ⅰ、Ⅲ胶原含量, IL-1,IL-6, IL-8, TGF-β均低于假治疗组与模型组(P0.05),IL-10,TNF-α则高于假治疗组和模型组(P0.05)。模型组和假治疗组之间desmin、GFAP、α-SMA水平,组织中Ⅰ、Ⅲ胶原含量,IL-1,IL-6, IL-8, IL-10,TNF-α, TGF-β的表达水平无明显差异性(P0.05) 3.定植在胰腺内的MSCs周围可见凋亡的胰腺细胞。结论 1.骨髓间充质干细胞能够减轻胰腺炎炎症反应,降低胰腺星状细胞的活化、增殖、分化,减少胶原纤维的沉积,减轻甚至逆转胰腺纤维化。 2.骨髓间充质干细胞输入慢性胰腺炎大鼠模型个体体内,能够定植在损伤的胰腺中,修复受损的胰腺组织,能够为临床研究提供一定的依据。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R576

【参考文献】