MSCs通过改变巨噬细胞极化状态治疗AIH小鼠的实验研究

发布时间：2020-06-24 23:00

【摘要】：目的:自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)是由自身免疫介导的慢性进展性肝脏炎症性疾病。有研究证实间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)在AIH的治疗中已经取得了一定的临床效果,但具体机制尚有争议。越来越多的研究证明巨噬细胞在参与MSC修复损伤肝脏具有重要作用,但巨噬细胞通过何种方法影响间充质干细胞修复损伤肝脏的机制尚不明确。人们普遍认为炎症与氧化应激有关,而Nrf2是机体防御氧化应激的关键因子,可促进HO-1的转录,HO-1调节并参与机体的抗炎、抗凋亡及抗氧化应激,在巨噬细胞中普遍表达。现已有研究证明HO-1刺激M1型巨噬细胞转化M2型巨噬细胞,本研究通过移植间充质干细胞治疗小鼠自身免疫性肝炎,探讨间充质干细胞移植后肝脏内M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的数量变化是否与HO-1有关。探讨HO-1与巨噬细胞的极化及间充质干细胞的治疗效果是否具有相关性,为将来开展间充质干细胞治疗自身免疫性肝炎提供理论依据。方法:第一部分:小鼠骨髓间充质干细胞移植治疗自身免疫性肝炎小鼠1、建立急性AIH小鼠模型:雌性小鼠经鼠尾注射ConA构建急性自身免疫性肝炎模型。造模后检测血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶及肝脏组织病理结果确定模型是否成功。2、小鼠骨髓间充质干细胞疗效评价:在AIH小鼠成模后,将其分为AIH+MSCs组和AIH组,AIH模型小鼠经鼠尾静脉注射间充质干细胞,对照的AIH组小鼠经鼠尾注射等体积的PBS,正常组注射等体积的PBS。比较三组小鼠的肝功能、肝脏病理、肝细胞凋亡及增殖情况,ELISA检测小鼠上清中TNF-αIFN-γ、IL-6的表达情况,RT-PCR检测肝脏组织中TNF-αIFN-γ、IL-6的表达情况,以评估间充质干细胞对急性自身免疫性肝炎小鼠的疗效。第二部分:小鼠骨髓间充质干细胞治疗中巨噬细胞极化状态的机制研究1、小鼠中肝内巨噬细胞的M1/M2的分布情况:用HO-1抑制剂Znpp和激动剂Hemin将其分为AIH+MSCs+Znpp组和AIH+Hemin组。免疫荧光双染检测AIH组、AIH+MSCs组、AIH+MSCs+Znpp组和AIH+Hemin组小鼠肝脏组织中M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的分布情况。RT-PCR检测INOS、Arg1在mRNA表达以反映肝脏组织中M1型巨噬细胞(INOS)和M2型巨噬细胞(Arg1)的分布情况。2、巨噬细胞极化的分子通路:在正常组、AIH组、AIH+MSCs组、AIH+MSCs+Znpp组和AIH+Hemin组,应用Western、RT-PCR检测各组肝脏组织中HO-1、Nrf2的表达情况。检测各组脏组织的病理变化、肝脏组织的凋亡和增殖情况及小鼠上清中及肝脏组织中TNF-αIFN-γ、IL-6的表达情况。结果:第一部分:间充质干细胞移植治疗自身免疫性肝炎小鼠的实验研究1、自身免疫性肝炎模型评价:与正常组比较AIH组血清生化指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶明显增高,差异具有统计学意义(P0.05)。肝脏病理示炎症细胞浸润肝脏组织,大量的肝脏细胞坏死,肝内血管扩张,间充质充血,肝窦组织紊乱,出现核固缩、核碎裂、核溶解,符合AIH模型标准,建模成立。2、疗效评价:与AIH组相比,经MSCs治疗后的AIH小鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶下降;肝脏病理观察到肝脏细胞坏死、间充质充血、肝窦组织紊乱、核固缩、核碎裂、核溶解情况得到改善;肝细胞凋亡得到明显改善;肝细胞增殖明显;TNF-αIFN-γ、IL-6的表达降低,以上指标差异具有统计学意义(P0.05)。第二部分:巨噬细胞极化状态的机制研究1、与AIH组相比,MSCs组小鼠以M2型巨噬细胞为主,而AIH组以M1型巨噬细胞为主,差异具有统计学意义(P0.05)。2、巨噬细胞极化的分子通路:与AIH组和AIH+MSCs+Znpp组相比较,在MSCs和Hemin移植治疗的AIH小鼠,肝脏的坏死、核固缩、核碎裂、核溶解情况得到明显改善;Nrf2和HO-1的表达增加。M2型巨噬细胞表达升高,而M1型巨噬细胞表达受到抑制;肝脏细胞凋亡情况得到明显改善,肝细胞增殖明显增多,差异具有统计学意义(P0.05);促炎因子TNF-αIFN-γ、IL-6表达降低,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:(1)ConA诱导的自身免疫性肝炎小鼠模型可模拟自身免疫性肝炎患者的病理、肝损伤及炎症情况。小鼠骨髓间充质干细胞改善自身免疫性肝炎小鼠的肝功能及受损肝组织,减少肝细胞的凋亡,增加肝细胞的增殖,抑制促炎因子的表达。(2)MSCs通过Nrf2/HO-1信号通路,促进肝脏组织中M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化,维持自身免疫性肝炎小鼠模型肝脏炎症内环境稳定,发挥其保护肝组织的作用。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.1
【图文】：

自身免疫性肝炎小鼠模型：（A）正常组小鼠肝脏组织HE染色；（B）AIH小鼠肝脏组织HE染色

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图 2、自身免疫性肝炎小鼠模型：正常和 AIH 组小鼠血清中 ALT 和 AST 水平检测，#P＜0.01.2.2 MSCs 移植对自身免疫性肝炎小鼠的影响为探究 MSCs 的移植是否对自身免疫性肝炎小鼠的肝脏有保护作用，我将培养好的 MSCs 以 1×106个鼠尾静脉注射进 AIH 小鼠体内。在 ConA 注射12 小时，与 AIH 组相比，在 MSCs 移植治疗后的 AIH 小鼠的肝脏病理发现细胞坏死区域减少，细胞核固缩、核碎裂、核溶解和肝细胞间质出血情况得改善（图 3）；肝脏功能水平显著低于 AIH 组（图 4），差异具有统计学意（P＜0.05）。为了进一步分析 MSCs 对肝脏的保护作用，用 TUNEL 免疫荧染色比较分析了 AIH 组小鼠和 MSCs 组移植治疗后的 AIH 小鼠肝细胞凋亡况。结果表明 MSCs 移植治疗的 AIH 小鼠 TUNEL 阳性细胞数即绿色荧光标的肝细胞凋亡数明显减少（P＜0.05）（图 5）。为明确 MSCs 对肝细胞再生影响，我们应用免疫组化技术比较 AIH 组和 AIH＋MSC 组小鼠 Ki-67 阳性细胞数量。结果发现与 AIH 组相比，MSCs 的移植治疗显著上调 AIH 小鼠 Ki的阳性细胞数量（P＜0.05）（图 6）。这些结果表明 MSCs 能改善 AIH 小鼠肝损伤，减少肝脏细胞坏死和凋亡，增加肝细胞的增殖。

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