降低SFRS10基因表达对小鼠AML-12细胞中SIRT1和Lipin-1表达水平的影响

发布时间：2020-06-25 07:28

【摘要】：目的:酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是指由于长期饮酒或短期内大量饮酒引起的肝损伤。其病因明确,但发病机制复杂多样,尚未被完全阐明。我们团队前期通过酒精灌胃法建立大鼠ALD模型,发现酒精刺激后引起沉默信息调节因子1(sirtuin1,SIRT1)、精氨酸/丝氨酸剪接因子10(splicing factor,arginine/serine-rich 10,SFRS10)的m RNA及蛋白表达水平逐渐下降。SFRS10可以引起Lipin-1选择性剪接,从而形成不同的异构体。随后我们在细胞水平,给予AML-12小鼠肝细胞梯度酒精刺激培养,建立酒精性肝细胞模型,并降低SIRT1表达,发现SIRT1低表达导致SFRS10表达水平下降,总Lipin-1及Lipin-1β表达水平升高,而Lipin-1α表达水平则显著降低。本研究选用能代谢酒精的AML-12小鼠肝细胞,应用SFRS10si RNA降低AML-12小鼠肝细胞内SFRS10表达,应用油红O染色法观察细胞内脂质沉积;在细胞水平阐释降低SFRS10表达对SIRT1和Lipin-1表达水平的影响。方法:复苏小鼠AML-12细胞给予含10%胎牛血清、1%丙酮酸钠、1‰HEPES、1%青-链霉素抗体的高糖DMEM培养基在5%CO2,37℃恒温条件下培养细胞至对数生长期,降低SFRS10基因表达,分别设置空白对照组(Blank)、SFRS10si RNA阴性对照组(SFRS10si RNA NC)、SFRS10si RNA组、SFRS10si RNA+酒精组。阴性对照组及实验组分别将SFRS10si RNA阴性无关对照序列、SFRS10si RNA转染至AML-12细胞,空白对照组中加入等体积的脂质体,培养4-6h后,更换为新鲜完全培养液继续培养至18-24小时,SFRS10si RNA+酒精组中加入120m M浓度的酒精,其余三组加入相同体积的生理盐水,继续培养24h,收集细胞。分别应用RT-q PCR和Western blot法检测SFRS10、SIRT1、Lipin-1、Lipin-1α、Lipin-1β的m RNA及蛋白表达水平;用4%多聚甲醛固定,给予行油红O染色观察细胞内脂质沉积情况。结果:1降低小鼠AML-12细胞中SFRS10表达,通过RT-q PCR法检测SIRT1、SFRS10、总Lipin-1、Lipin-1α及Lipin-1βm RNA的表达水平,正常AML-12细胞SIRT1、SFRS10、细胞核内Lipin-1α表达水平相对较高,总Lipin-1及细胞质内Lipin-1β表达水平均较低;与空白对照组相比,SFRS10si RNA组SFRS10的表达显著降低,SIRT1及总Lipin-1的表达水平无明显变化(P均0.05);细胞质中Lipin-1β表达水平明显升高,而细胞核中Lipin-1α表达水平明显降低(P均0.01);与SFRS10si RNA组比较,SFRS10si RNA+酒精组中,SFRS10、Lipin-1α表达水平进一步降低(P均0.01),SIRT1表达水平也出现明显降低(P0.01),Lipin-1β表达水平进一步上升,总Lipin-1表达水平也出现明显升高(P均0.01);与空白对照组相比SFRS10si RNA NC组内各指标表达水平无明显差异(P均0.05)。降低SFRS10基因表达后,与空白对照组相比,SFRS10si RNA NC组无明显变化(P0.05),SFRS10si RNA组Lipin-1β/α的比值显著升高(P0.01);而且SFRS10si RNA+酒精组,Lipin-1β/α的比值进一步增高,差异有统计学意义(P0.01)。2降低SFRS10表达后,通过Western blot法检测SIRT1、SFRS10、总Lipin-1、Lipin-1β及Lipin-1α的蛋白表达水平,我们发现与RT-q PCR法检测结果一致:正常AML-12细胞中SIRT1、SFRS10和Lipin-1α蛋白表达水平较高,而Lipin-1及Lipin-1β表达水平较低;与空白对照组相比,SFRS10si RNA组中SFRS10的表达显著降低,细胞质中Lipin-1β表达水平明显升高,细胞核中Lipin-1α表达水平明显降低(P均0.01),而SIRT1及总Lipin-1的表达水平无明显变化(P0.05);SFRS10si RNA+酒精组中,SFRS10、Lipin-1α表达水平进一步下降(P均0.01);SIRT1表达水平也出现明显降低(P0.01);细胞质中Lipin-1β表达水平进一步升高,总Lipin-1表达水平也出现明显升高(P均0.01);与空白对照组相比,SFRS10si RNA阴性对照组中各个指标表达无明显差异(P均0.05)。降低SFRS10表达后,与空白对照组相比,SFRS10si RNA NC组无明显变化(P0.05),SFRS10si RNA组Lipin-1β/α的比值显著升高(P0.01);SFRS10si RNA+酒精组,Lipin-1β/α的比值进一步增高,差异有统计学意义(P0.01)。3通过油红O染色法观察小鼠AML-12细胞,比较各组间脂质变化情况,我们发现:正常对照组及阴性对照组中AML-12细胞内未见明显脂肪变性;通过基因工程技术降低SFRS10表达后,SFRS10si RNA组中AML-12细胞内可见较多的红色脂滴;而SFRS10si RNA+酒精组中AML-12细胞内可见大量的红色脂滴。结论:SFRS10表达降低对SIRT1无显著影响,它可能作为上游因子通过调节Lipin-1的选择性剪接,改变Lipin-1β/α比值引起肝细胞脂肪变性。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575

【参考文献】