【摘要】：目的:P2X7受体是一种ATP介导的门控离子通道,在炎症反应中发挥重要作用。P2X7受体的活化可以导致NLRP3炎性小体的组装并最终导致IL-1β的释放。我们前期研究发现,P2X7R-NLRP3信号通路的活化能导致肝星状细胞胞外基质沉积,促进肝纤维化的进程,但目前P2X7R-NLRP3信号通路在酒精性脂肪性肝炎中的作用仍不清楚。因此本研究的目的是通过沉默或抑制P2X7受体探讨P2X7R-NLRP3信号通路对酒精性肝脏脂肪性肝炎中肝脏脂肪蓄积和炎症的作用及机制。方法:1.体内实验首先使用C57BL/6小鼠通过酒精灌胃和慢性酒精喂养加急性酒精灌胃分别建立急、慢性酒精性肝损伤模型,然后选择急性酒精性肝损伤模型分别使用P2X7R的选择性抑制剂A438079或者P2X7R SiRNA造成小鼠P2X7R抑制或沉默,观察P2X7R在酒精性脂肪性肝炎的作用;并使用氯膦酸盐脂质体耗竭小鼠体内巨噬细胞,观察酒精性脂肪性肝炎中巨噬细胞对肝脏脂肪蓄积的影响。1)急性酒精性肝损伤模型:小鼠随机分为5组,正常组和末次酒精灌胃后4、12、24和48小时处死组,每组5只小鼠。酒精灌胃小鼠每12小时给与5 g/kg酒精灌胃一次,共3次,末次酒精灌胃后在相对应时间进行处死,正常组与4小时组一同处死,取肝脏和血液随后检测血清中ALT、TG、IL-1β以及肝脏组织中TG的含量并通过HE染色和F4/80免疫荧光染色小鼠肝脏脂肪蓄积和巨噬细胞募集情况,通过Q-PCR检测小鼠肝脏组织中Fasn、Scd1、CXCL1和CXCL2的mRNA水平。2)慢性酒精性肝损伤模型:小鼠随机分为两组,对照组和酒精喂养加酒精灌胃组(下文简称酒精组),每组6只小鼠。模型的建立过程如下:酒精组给与酒精含量逐天增加1%(V/V)的液体Lieber-DeCarli饲料,待液体酒精含量达5%(V/V)后,持续喂养10天,第11天给与5 g/kg的酒精灌胃一次;对照组给与对照饲料,并且根据酒精含量的变化加入同等热量的麦芽糖糊精,酒精组小鼠酒精灌胃时正常组小鼠则同时给与等热量的麦芽糖糊精灌胃;酒精灌胃后9小时,对小鼠进行乙醚麻醉,并取血和肝脏,通过Q-PCR检测小鼠肝脏组织中SREBP1的靶基因Fasn、Scd1、Acly以及PPARα的靶基因Cd36、Cpt2和P2x7r、Nlp3 Cxcl1、Cxcl2、Prkαα1、Sk11的mRNA水平。3)急性酒精性肝损伤加A438079模型:小鼠随机分为正常组、酒精组及酒精加A438079组,每组5只小鼠。酒精模型的建立同急性酒精性肝损伤模型,酒精加A438079组在酒精灌胃后30分钟后皮下注射A438079(30mg/kg),末次酒精灌胃后4小时处死所有小鼠,存留血清及肝脏,随后检测血清中ALT、TG及肝脏中TG的含量;通过QPCR检测IL-1β、Fasn、Scd1、CXCL1和CXCL2的mRNA水平;通过HE染色、尼罗红染色和油红O染色观察小鼠肝脏组织脂肪蓄积情况;通过F4/80免疫荧光实验观察巨噬细胞募集情况;通过免疫组织化学染色观察小鼠肝脏组织中SREBP1和HMGB1的表达情况。4)急性酒精性肝损伤加P2X7R SiRNA模型:小鼠随机分为7组,分别为正常组、对照组、P2X7RSiRNA64、65组、酒精组及酒精加P2X7RSiRNA64、65组。SiRNA组将SiRNA(7.5 nmol)经尾静脉注射入小鼠体内,48小时后进行第2次尾静脉注射,然后1小时后对三组酒精组的小鼠进行酒精灌胃造成急性酒精性肝损伤模型,随后检测血清中ALT、TG及肝脏中TG的含量;通过HE染色、尼罗红染色和油红O染色观察小鼠肝脏组织脂肪蓄积情况;通过免疫组织化学染色观察小鼠肝脏组织中SREBP1和HMGB1的表达情况;通过QPCR检测IL-1β、Fasn、Scd1、Acly和Cpt2的 mRNA 水平。5)巨噬细胞耗竭模型:小鼠随机分为4组(n=6),分别为PBS脂质体组,氯膦酸盐脂质体组,PBS脂质体加乙醇组以及氯膦酸盐脂质体加乙醇组。通过小鼠尾静脉将150μLPBS脂质体或氯膦酸盐脂质体注入小鼠体内。末次注射后48小时,建立急性酒精性肝损伤模型,取小鼠肝脏,通过F4/80荧光染色检测巨噬细胞耗竭情况,通过HE或尼罗红染色实验观察巨噬细胞耗竭对酒精灌胃造成的肝脏脂肪蓄积的影响。2.体外实验部分使用酒精或者LPS/ATP对小鼠原代肝细胞、HepG2或HepG2-ADH1细胞进行刺激,观察A438079或P2X7R SiRNA对肝细胞脂肪变性或炎症反应的作用。1)通过胶原酶灌注法分离小鼠原代肝细胞进行体外培养,并分别使用酒精或者LPS/ATP对其进行刺激,通过免疫荧光染色实验观察小鼠原代肝细胞中SREBP1的表达情况,通过油红O染色实验观察小鼠原代肝细胞中脂肪蓄积情况并通过蛋白印迹实验观察IL-1β及HMGB1的表达情况;2)酒精或者LPS/ATP对小鼠原代肝细胞进行刺激同时P2X7R的选择性抑制剂A438079、TLR4抑制剂CLI-095及Caspase1抑制剂Ⅳ,使用蛋白印迹实验观察Caspase1、ASC、IL-1β以及HMGB1的表达情况;3)使用不同浓度的酒精对分别对HepG2以及HepG2-ADH1细胞进行刺激,使用免疫荧光染色方法观察HMGB1的表达及位置,并提取HepG2-ADH1细胞的总蛋白、浆蛋白以及核蛋白,并浓缩上清,使用蛋白印迹实验观察HMGB1在各组分中的表达情况。4)使用酒精对HepG2细胞进行刺激,并同时给与A438079及Caspase1抑制剂IV,通过免疫荧光实验观察SREBP1的表达情况,并提取蛋白通过蛋白印迹实验检测不同处理下LKBI、AMPK以及P-LKB1和P-AMPK表达的变化。结果:1.体内实验中,急慢性酒精性肝损伤模型中均出现小鼠肝脏脂肪蓄积和炎症相关因子表达;急性酒精性肝损伤模型中,末次酒精灌胃4小时后小鼠肝脏脂肪蓄积最为明显;慢性P2X7R选择性抑制剂A438079和P2X7R SiRNA对P2X7R的抑制或沉默均可以减少小鼠血清中ALT、TG以及肝脏组织中TG的含量,下调SREBP1的表达,减少小鼠肝脏中的脂肪蓄积并下调炎症相关蛋白NLRP3、ASC、HMGB1等表达水平;另外A438079给与后酒精造成的小鼠肝脏中巨噬细胞的募集以及HMGB1由细胞核向细胞浆的转移得到抑制;P2X7R SiRNA减少P2X7R在小鼠肝脏中的表达,降低了SREBP1靶基因Fasn、Scd1、Acly并上调PPARα的靶基因Cpt2的表达;巨噬细胞的耗竭可以缓解酒精暴露导致的小鼠肝脏中的脂肪蓄积。2.体外实验中,ETOH或LPS/ATP的刺激均可以造成肝细胞中脂肪沉积,升高小鼠原代肝细胞中SREBP1和IL-1β的表达水平;A438079、TLR4抑制剂CLI-095及Caspase1抑制剂IV可以减少P2X7R-NLRP3通路相关蛋白的表达水平,减少IL-1β的表达及释放;酒精性浓度依赖性的造成HepG2及HepG2-ADH1中HMGB1由细胞核向细胞浆的转移:另外酒精暴露导致的HepG2中LKB1-AMPK的抑制,在给与A438079和Caspase1抑制剂IV后得到恢复。结论:P2X7受体的抑制或沉默通过阻断P2X7R-NLRP3信号轴减少肝脏脂肪积累和IL-1β以及其他炎性因子的释放从而减少ASH过程中的脂肪变性和炎症反应;肝细胞中存在依赖于P2X7R-NLRP3的IL-1β释放途径;寻找P2X7R-NLRP3炎性小体信号通路的安全有效的抑制剂是治疗ASH一项新选择。
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.1
【图文】：
图２．邋ＮＬＲＰ３炎性体组装的示意图
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2732584
