慢性乙型肝炎患者低血清HBsAg水平发生机制的研究

发布时间：2020-06-29 16:26

【摘要】： 目的慢性乙型肝炎患者外周血中含有大量乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus,HBV)的表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg),每毫升血清中HBsAg的水平通常在数千至数万国际单位。但在临床上也可发现,少部分慢性HBV感染者的血清HBsAg水平较低,即使存在HBV的复制(HBV DNA≥10~4拷贝/ml),其HBsAg水平仍低于250IU/ml。本文主要探讨慢性HBV感染者低血清HBsAg水平的发生机制。 材料与方法HBV标志物的检测采用雅培公司试剂,在雅培公司ARCHITECT i2000SR仪器上进行。HBV DNA检测采用达安公司实时荧光定量PCR试剂盒。 通过分析1783例慢性HBV感染者血清标本HBV标志物的检测结果,收集HBsAg水平低于250IU/ml的血清标本与生化学、HBV DNA及临床资料。采用酚/氯仿方法抽提血清中的HBV DNA,并对HBV S基因区进行PCR扩增及测序。对其中4例出现S基因变异的血清标本,进行全基因扩增并测序,从而得到血清HBV全基因序列。 将4例标本的全基因扩增产物进行克隆及测序,与血清中HBV全基因序列进行比较,挑选出代表优势株的克隆。将HBV优势株的小S蛋白基因克隆至pXF3H真核表达载体,在小S蛋白的氨基端加入HA标签蛋白。将该表达载体分别转染Huh7及Hela细胞,用ARCHITECT HBsAg QT方法检测上清液HBsAg的水平。用针对HA的抗体进行免疫印迹实验,检测细胞内及上清液中含HA标签蛋白的HBsAg表达量。 结果在1783份标本中,HBsAg水平低于250IU/ml且HBVDNA大于1X10~4拷贝/ml的患者35例。故HBsAg水平低于250IU/ml且HBVDNA大于1X10~4拷贝/ml发生率为1.87%。通过分析16例HBsAg水平患者的HBVS基因区氨基酸序列,结果发现,有15例患者的HBV S基因氨基酸序列发生了变异,其中报道较多的位点包括:sT120T,sT/I126N,sQ129/N,sG130/R,sT131N,sM133T。少有报道的位点为:sN40S,sI68T,sC76Y,sL95W,sV96G,sL98V,sS117T,sA157D,sW196L,sF220L。发现S13患者S区的启动子(nt2976-3174)缺失,在15个克隆中,有13个克隆存在此区域的缺失。S15患者HBV S基因的第220位核苷酸碱基由T变为A,使S基因22位密码子由亮氨酸(UUA)变为终止密码子(UAG)。对4例患者的HBV的全基因进行了扩增,成功克隆了HBV全基因。 将S11(含有sQ129/N变异位点)和S14(含有sT/I126N及sT131N变异位点)的优势株小S基因克隆至pXF3H质粒,并转染细胞,发现上清中HBsAg水平较野毒株水平低2-4倍,但用针对HA抗体进行免疫印迹检测,发现这两例患者HBV优势株的HBsAg的表达量较野毒株明显增加,糖基化HBsAg的比例明显增多,而细胞裂解液中HBsAg表达量也显著增加。用针对小S蛋白多克隆抗体进行免疫印迹检测,发现细胞裂解液中HBsAg不能被检测出来。 结论大多数慢性HBV感染者(90%以上)的血清HBsAg水平在250IU/ml以上。在HBV DNA大于1X10~4拷贝/ml慢性HBV感染者中,低于250IU/ml的患者占1.87%。HBV S基因区某些氨基酸的变异是造成低HBsAg水平的主要因素。S基因区氨基酸变异引起低HBsAg水平的机制主要是S基因区某些氨基酸变异为天门冬酰胺(asparagine,即N)后,容易使HBsAg糖基化,小S蛋白过度糖基化将影响其空间构型,进而影响其抗原性,造成其检测水平的降低,而HBsAg的表达并未受到影响,2例患者HBV优势株的HBsAg的表达显著增加。其它机制还包括S基因启动子的缺失和出现终止变异等。总之,多种机制导致了某些慢性HBV感染患者血清中呈现低HBsAg水平。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R512.62
【图文】：

8)将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50一100贝洗脱液EB，室温放置Zmin， 12000r/min离心lmin将质粒收集在离心管中。抽提质粒后，同样用Sacl在37℃酶切3h，琼脂糖凝胶电泳鉴定(见图1一l)。犷又年、、勺、、%、孕令令牵小中3000bp2000bP1000bp图1一1将全基因克隆质粒以sacl酶切鉴定，酶切后载体片段长度约为2700bp，HBV基因组片段长度约为32O0bp。

Germany研究机构的陆蒙吉教授馈赠，该质粒从PRKS质粒改造得来，为真核表达载体，上游包括CMV启动子，HBsAg基因是用EcoRI和Psil酶切克隆到载体上，在HBsAg的N端连接HA蛋白标签(见图2一1)。同时还馈赠含野毒株s区和含sT123N变异的S区的pXF3H质粒。pEGFp一N3质粒(购于美国Clonteeh公司)。1O6卜-曰图2一1为pxF3H质粒载体的结构图， HAtag连接在HBsAg的N端，在EcoRI和Pstl酶切位点之间接入HBsAg。2.细胞系人肝癌细胞系Huh7保存于液氮中，复苏后培养于含10%的胎牛血清，ZmM

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 原明达;;用胃酶、尿素及福马林三种方法灭活乙型肝炎病毒[J];国际生物制品学杂志;1984年01期

2 苏建家;杨春;黄定瑞;黄国华;严瑞琪;;供乙肝疫苗质检用的新动物模型——乙肝疫苗预防树

本文编号：2734075