乙醇对人肝LO2细胞糖原和GSK-3β、P-AMPK的影响

发布时间：2020-06-30 02:03

【摘要】： 背景: 饮酒过量已成为严重社会问题,乙醇是现代社会滥用最广的成瘾物质。流行病学调查显示,过量摄入乙醇可对机体产生多方面不利影响,如酒精性肝炎、脂肪肝等,并可影响糖、脂肪、蛋白质等物质的体内代谢。正常血糖水平对维持机体能量代谢有着重要作用,而乙醇摄入对糖代谢的影响已引起广泛关注。资料显示,急性乙醇中毒可导致严重低血糖,但在一定条件下,乙醇又可导致高血糖,并认为这主要取决于体内糖原储备是否充足。研究乙醇对糖原代谢的影响具有重要意义。糖原合成与分解是肝脏生化功能的重要方面,它不仅为自身的生理活动提供能量,也为其他器官的能量需要提供葡萄糖,血糖水平下降引起机体储备的糖原分解和糖异生作用增强。糖原合酶(glycogen synthase,GS)是糖原合成过程的关键酶,其活性受到磷酸化形式的调节。糖原合成酶激酶-3(glycogen synthasekinase-3,GSK-3)则可在体内磷酸化糖原合酶,使其失活,负调控糖原合成。GSK-3为丝/苏氨酸蛋白激酶,有两个同功异构体,分别是GSK-3α、GSK-3β。GSK-3本身亦可被磷酸化(GSK-3α的Ser~(21)或GSK-3β的Ser~9)而失活,使得糖原合酶的磷酸化受到抑制,从而促进糖原合成。测定GSK-3的水平,能反映出活性GS的表达状况。目前研究较多集中于GSK-3β。有研究认为,乙醇摄入后可减少大鼠肝脏糖原含量,降低大鼠肝脏糖原合酶的活性及表达,但并未报道对GSK-3β的影响,亦未见关于乙醇对人类肝细胞GSK-3β影响的报道。腺苷酸激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)为外周组织细胞内的能量感受器,近年来被认为与糖代谢过程关系密切,它有α、β、γ三个亚单位,细胞内AMP/ATP比值升高可激活AMPK,其中α亚单位Thr~(172)的磷酸化(P-AMPK)对AMPK激活,发挥其激酶活性至关重要。每克乙醇本身可提供热量7.1kcal/g,干扰机体能量代谢。目前有研究报道,乙醇作用后,小鼠的AMPK活性可增强或降低,而对于乙醇对人类肝细胞反应能量代谢的AMPK的影响以及AMPK对GSK-3的变化又有何影响目前仍是未知领域。乙醇对糖原代谢过程的研究较少,而对人类肝细胞糖原代谢的影响更是罕见报道。本研究选取正常人类肝L02细胞作为研究对象,观察乙醇直接作用后,人肝L02细胞内糖原含量变化,并进一步研究乙醇对糖原合成代谢过程中的关键酶GSK-3β的影响、P-AMPK的表达变化,初步探讨P-AMPK对GSK-3β的影响。目的: 1、研究乙醇对体外培养的人肝L02细胞糖原含量及GSK-3β、P-AMPK的影响。 2、通过加入AMPK的激动剂(5-Aminoimidazole-4-carboxamide -1-b-Dribofur-anoside,AICAR)与阻断剂(6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)-phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyyrazolo[1,5-a]pyrimidine,Compound C),间接观察P-AMPK对GSK-3β的影响。方法: 人肝L02细胞于37℃、5%CO2条件下在改良RPMI 1640中培养,0.25%胰酶消化传代,每2-3 d换液。在处于对数生长期的细胞中加入乙醇,并按加入乙醇浓度的不同分为0 mmol/L组、50 mmol/L组、100 mmol/L组,0 mmol/L组细胞正常换液,培养24 h后,收集细胞;采用蒽酮-硫酸比色法测定细胞糖原浓度,同时提取细胞DNA并测定浓度;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测GSK-3β及P-AMPK表达水平;并用AICAR(0.5 mmol/L)和Compound C(10μmol/L)预处理0mmol/L组和100 mmol/L组细胞1h,再与乙醇共同作用24 h,检测GSK-3β蛋白表达。结果采用SPSS11.5进行统计分析。结果: 1、50 mmol/L组和100 mmol/L组分别与0 mmol/L组相比较: (1)L02细胞内糖原含量分别下降41.3%(P＜0.01)和52.8%(P＜0.01); (2)GSK-3β表达相对水平分别增加15.2%(P=0.011)和20.1%(P=0.002); (3)P-AMPK表达相对水平分别增加8.99%(P=0.002)和10.3%(P=0.001); (4)50 mmol/L和100 mmol/L两组比较,糖原含量、GSK-3β及P-AMPK表达相对水平均未见明显统计学意义。 2、加入AICAR和Compound C后,0 mmol/L组和100 mmol/L组GSK-3β表达均未见明显变化,两组间未见明显统计学意义。结论: 1、乙醇作用后明显降低体外培养的人肝L02细胞内糖原含量,可能干扰其糖原合成。 2、乙醇作用后人肝L02细胞内GSK-3β表达增加,推测其与糖原含量下降有关。 3、乙醇作用后P-AMPK表达增加,推测乙醇干扰了L02细胞的能量变化,导致P-AMPK的变化,并且AMPK的变化可能促进了糖原合成代谢的下降。 4、加入AICAR后,0 mmol/L组和100 mmol/L组GSK-3β表达均未见明显变化,提示乙醇引起糖原含量变化的过程中,P-AMPK与GSK-3β未见明显的相关性。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R575
【图文】：

糖原含量,乙醇,组间,测定值

表2乙醇培养24h后各组糖原含量测定值比较的统计学分析(x士s，n=6)Table2StatistiesofGlyeogeneontentafterethanolexPosurefor24h(壮s，n=695%ConfideneeIn;ig.一235000000235000000乙醇组别(mmol几)LSDO50100100100MC即Dill七rCnCC(I一J).013426(*).017148(*)一013426(*).003722一017148(*)一003722Std.Error.00300670030067.0030067.0030067.0030067.0030067LowerBound.007017.010739一019835一002687一023556一010130UB.一.一.*Themeandifferenee15signifieantatthe.05level.

乙醇处理,蛋白表达

0Illmol几50mmo比100mmo比图3不同乙醇处理组GSK一邓蛋白表达水Fig.3ExPressionofGSK一3pindiffereniethgrouPsbywesternblot0加叨01几50n.01几1

【参考文献】