人脐血间充质干细胞移植治疗肝硬化大鼠的实验研究

发布时间：2020-07-02 02:06

【摘要】：目的：通过建立肝硬化的动物模型,并制备人脐血来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells MSCs),研究脐血MSCs移植对肝硬化大鼠的治疗作用,探讨移植的脐血MSCs能否在肝硬化大鼠的肝内定植、分化,表达人肝细胞标志物基因。方法： 1.复合因素法(40%CCL4油剂皮下注射+20%酒精饮用水+高脂饮食)诱导大鼠的肝硬化模型,HE及Masson染色检测建模是否成功。 2.无菌条件下采集新生儿脐带血,密度梯度离心法分离获得人脐血单个核细胞,通过培养、纯化、传代扩增得到脐血MSCs,流式细胞仪检测其细胞表面抗原(CD29、CD105、CD34、CD45),5-溴-2-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2-deoxyuridine Brdu)在体外对细胞进行标记,免疫荧光法检测标记是否成功。 3.将建模成功的肝硬化大鼠随机分为：A组,门静脉移植实验组(n=20)：经门静脉移植脐血MSCs1ml;B组,门静脉移植对照组(n=20)：经门静脉注射等体积的PBS。正常大鼠也随机分为2组：C组,门静脉移植正常组(n=10)：经门静脉移植脐血MSCs1ml；D组,正常对照组(n=10)：普食普水喂养。移植四周后处死各组大鼠,下腔静脉采血进行肝功能及免疫相关指标检测；HE及Masson染色了解各组大鼠脐血MSCs移植后的组织病理改变；免疫组织化学技术、免疫荧光法检测经Brdu标记的脐血MSCs的定植情况；RT-PCR技术检测肝硬化大鼠的肝组织是否有人源性肝细胞标志物基因的表达。结果： 1.复合因素法建模8周可成功诱导大鼠肝硬化模型,HE染色示：大鼠的正常肝小叶结构破坏,被假小叶所取代,假小叶内肝细胞有不同程度变性和坏死,可见炎性细胞浸润。Masson染色：模型组大鼠可见清晰典型假小叶结构,胶原纤维呈蓝色。 2.成功分离培养出人脐血MSCs,可见P3代细胞形态呈相对均一的长梭行,平行排列或旋涡状生长,流式细胞仪检测提示其细胞表型CD29、CD105表达率高,分别为93.37%、89.08%。免疫荧光检测示,Brdu在体外可成功标记脐血MSCs。 3.脐血MSCs经门静脉移植4周后,A组大鼠的一般情况好转,体重较移植前及B组相比明显上升(P0.05)；肝功能与B组相比,ALT、AST、TBIL、ALB均有明显改善(P0.05)。病理结果示：A组与B组相比,肝细胞坏死、脂肪变以及肝纤维化等病变程度均有改善,经半定量分级评分显示差异有显著性(P0.05)。 4.脐血MSCs移植四周后,取A组大鼠肝组织进行免疫组织化学检查,可见经Brdu标记的阳性细胞,细胞核呈棕黄色在肝内定植；免疫荧光检测见Brdu标记的阳性细胞,细胞核发红色荧光在肝内定植；RT-PCR检测发现A组大鼠肝组织有人源性CK18mRNA、ALB mRNA的表达。 5.脐血MSCs移植4周后,C组与D组相比,大鼠体重变化无显著差异(P0.05)；ALT、AST、TBIL、ALB各指标均无显著差异(P0.05)；免疫相关指标IgA、IgG、IgM、C3、C4变化均无显著差异(P0.05)；C组大鼠肝组织、脾脏组织、肺组织、肾组织均有少量Brdu标记的阳性细胞定植,但各器官病理检测未发现瘤样生长,无病理改变。结论： 1.人脐血MSCs移植能在一定程度上改善肝硬化大鼠的肝功能及肝脏的组织学结构。 2.经门静脉移植的人脐血MSCs可在肝硬化大鼠肝内归巢定植并向肝样细胞分化。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R575.2

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