【摘要】：乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的主要公共卫生问题，慢性感染者超过3.6亿。HBV慢性感染是肝硬化（LC）和肝细胞癌（HCC）的主要危险因素。HBV在感染早期，尤其是在乙肝e抗原（HBeAg）阳性阶段，免疫选择较弱，病毒基因组以“野生序列”为主，随年龄增长，免疫选择增强，常导致HBeAg转换，病毒变异频率逐渐增加，尤其是在“慢性活动性乙肝-肝硬化-HCC”动态过程中逐渐形成了HCC相关HBV变异。 乙肝病毒属嗜肝DNA病毒，全长约3.2kb，由部分双链的松弛环状DNA组成，包含C、S、X、P四个开放阅读框，以往关于HBV的研究大多局限于某一基因片段，或是将多个区段重新拼接获得HBV全基因组序列，此方法有很大局限性。另外由于在我国人群感染的HBV是以B和C基因型为主，与其他基因型相比在HBeAg血清学转换的时间、疾病进展、预后及对干扰素治疗反应有不同的影响，而现存HBV野生序列多是用国外流行株全序列。因此我们首先建立我国HBV流行株的野生序列，建立HBV变异研究的基础工作，并进一步分析病毒变异与HBV相关肝病的关系。 另外，自从PCR扩增DNA技术推广以来，研究HBV基因组异质性及其致病机制和病毒蛋白表达成为嗜肝病毒研究重点。目前研究发现HBV前C区变异可导致HBeAg无法正常合成。表面抗原（HBsAg）免疫表位决定簇突变可诱导中和抗体的逃避，从而逃避免疫清除。在HBV基因组其他调控区的变异也多次被发现。然而大多数病毒变异致病机制及其生物功能和临床特征尚不明确。因此进行病毒体外研究是HBV研究的重要方面，但目前缺乏有效的HBV体外感染模型，极大地限制了HBV复制、转录机制和抗病毒等方面的研究。而且目前关于HBV编码蛋白功能的研究多是单组分研究，HBV全基因组病毒变异对宿主的整体影响鲜见报道。建立HBV全基因组感染细胞株是从整体水平研究HBV致病机制的重要途径。我们拟构建C基因型的野生型及变异型HBV全基因转染肝癌细胞系，并通过比较其复制表达水平，探讨病毒变异功能。 研究目的 建立HBV B和C基因型野生型全基因组序列，并在此基础上分析病毒突变与HBV相关肝病的联系，建立体外HBV野生型和变异型全长转染肝癌细胞株，进一步分析病毒突变对HBV复制表达的影响。 研究方法 分析了HBV B和C基因型694例HBeAg阳性的无症状表面抗原携带者（ASCs）,200例慢性乙型肝炎（CHB）患者，180例肝硬化患者和313例肝癌患者。ASC患者B和C基因型每个核苷酸位点出现频率最高的碱基被列为野生型，在此基础上共筛选出193个突变“热点”。多因素回归分析进一步确定了与肝硬化和肝癌独立相关的病毒突变。并建立HBV感染肝癌细胞株，进一步评价病毒突变功能。 研究结果 1.获得HBV B和C基因型全基因组野生序列。比较所有样本，HCC患者平均年龄较老，而且男性比例和基因型C比例均高于其他组。 2. LC和ASC,CHB之和比较， G1613A,C1653T，A1703G,G1719T,A1762T/G1764A, T1978C,A1979G,C2288A, T2857C,T2943G,C3000T, PreS2起始密码子突变，PreS1缺失可增加LC的发病风险, T1758C,A109T,T705C可降低加LC的发病风险；HCC和ASC,CHB，LC比较， C1653T，A1762T/G1764A, A1846T,G1896A,G1899A,C1969T,G2104A,A2189C,C2354A, A3012C, A3097C, T531C,T636A,T796G,PreS2起始密码子突变可增加HCC的HCC的发病风险；G1634H, G2011M， A162G,T705C可降低HCC的发病风险。 3.多因素回归分析表明，年龄大、男性、A1762T/G1764A、G1613A、 C3000T、preS2起始密码子突变是LC的独立危险因素, T705是可降低LC的发病风险；年龄大、A1762T/G1764A、 G1896A, G1899A, preS2起始密码子突变是HCC的独立危险因素。 4.单倍型研究表明大多数包含两个或两个以上突变位点的单倍型均和HCC显著相关。与HCC相关的突变位点中G1896A，G1899A，preS2起始密码子突变特异度较高，A1762T/G1764A有比较合适的敏感度和特异度。这些突变位点，无论是单独存在还是与其他变异组合都可以被HBV感染者作为HCC的指示标志。 5.体外转染HepG2细胞和Hep3B2.1-7细胞研究发现,野生型和包含不同变异组合的变异型HBV全长对病毒复制表达水平影响各异，变异型HBV-mt-4（变异组合为T1674C+T1753G+A1762T/G1764A+C1766T+G1896A+T3046C+A3150G+G3191A+T126C+preS2deletion(nt.1-55)+preS2start codon mutation+A162G+C928T+G957A+T2426A+T2498C），比其他变异型HBV在preS区多T3046C+A3150G+G3191A(F1016+S1050G+S1064N)三种突变，其HBsAg表达量最低；转染变异型HBV-mt-5（T1674G+A1762T/G1764A+G1896A+C3116T+preS2start codon mutation+A162G+A895T+G915A+T929A+C940A+A984G+A993G+C1075T+A1221T+G1230C+T1290G+G1317A+A1319C+C1347A+G1386A+C1480A+T1556A+C2444T+A2571G+A2590T+A2631G+C2651T+C2660T+G2699A+C2732T++G2741A+T2768G），在P区与其他变异型HBV相比多A895T+T929A++C940A+C1075T+G1230C+C1480A+T1556A+C2444T+A2574G+A2590T+2651T+C2660T+G2699A+C2732T++G2741A+T2768G (Q299K+L310Q+Q314K+R410Q+K494T++V519G+S815L+L858S+M864L+S884F+T887I+R900H+S911L+G914D+L923R)，少C928T+G957A+T2426A+T2498C (L310Q+L319I+I809N+L833P)，但DNA复制情况各组间无统计学意义。只有野生型HBV转染细胞表达HBeAg为阳性，其余变异型均为阴性。 结论 1.基因型C中A1762T/G1764A，G1613A， C3000T，PreS2起始密码子突变是LC的独立危险因素, T705是LC的保护因素； A1762T/G1764A， G1896A， G1899A, preS2起始密码子突变是HCC的独立危险因素。C3000T和T705是新发现的与LC独立相关的因素。 2.不同的HBV变异组合对肝癌细胞病毒复制表达影响各异，位于preS区的病毒突变T3046C-A3150G-G3191A组合可能通过影响preS区功能区结合位点影响HBsAg表达，前C区G1896A突变阻止HBeAg合成，也可减少DNA复制。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.62
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