Tim-4对小鼠免疫性肝炎的抑制作用研究

发布时间：2020-07-02 20:48

【摘要】： TIM基因家族是2001年在对哮喘的研究中发现的一个新基因家族,定位于小鼠染色体11B1.1,该区域与多种疾病的发生有密切的关系,如哮喘、过敏反应和自身免疫病等。小鼠Tim家族有8个基因,包括编码蛋白Tim-1～4和4个假想蛋白Tim-5～8。Tim-1表达在Th2细胞和活化的初始T细胞表面;Tim-2选择性表达于Th2细胞表面,负性调节Th2细胞的增殖分化及细胞因子的产生;Tim-3选择性表达在Th1细胞表面,负性调节Th1细胞介导的免疫应答;而Tim-4主要表达在活化的APC表面,然而它对APCs自身功能的影响尚未见有报道。近几年来的大量研究表明,表达于免疫细胞表面的Tim分子对免疫系统具有重要的调节作用。不同于其它的Tim分子,Tim-4并不表达在T细胞表面,而是在mRMA和蛋白水平都表达于APCs表面,特别是髓系来源的树突状细胞和巨噬细胞表面。研究表明,它与表达于T细胞表面的Tim-1分子或另一个未知的分子相互作用,向T细胞传导活化或抑制信号,这是Tim-4分子作为配体而发挥的功能。然而近来的研究表明,Tim-4可以作为磷脂酰丝氨酸的受体,通过与凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸结合,促进对凋亡细胞的吞噬,这是Tim-4分子作为受体的另一种功能展示。这也就提示,表达于APCs表面的Tim-4分子可能对APCs的活性具有一定的调节作用。为了明确Tim-4分子是否对APCs细胞具有调节作用,本课题组前期以巨噬细胞为研究模型,体外实验研究表明:小鼠巨噬细胞RAW264.7表达内源性Tim-4,经丝裂原LPS刺激后,Tim-4 mRNA及蛋白表达水平呈剂量依赖性上调;建立了过表达Tim-4的小鼠巨噬细胞系RAW264.7-Tim-4,利用该细胞系发现,Tim-4可通过影响NO分泌、iNOS、TNF-α的表达及共刺激分子CD80、CD86的表达负性调节小鼠巨噬细胞RAW264.7的生物学活性。基于以上实验结果,本研究拟利用小鼠免疫性肝炎模型进一步论证Tim-4在体内对巨噬细胞的负调控作用。大量的研究表明巨噬细胞对刀豆蛋白A(ConA)诱发的小鼠急性肝损伤模型发挥着重要的促进作用。因此,我们以这一经典模型为基础,在体内进一步论证Tim-4对巨噬细胞的抑制作用。首先,利用GdCl_3清除小鼠体内的巨噬细胞。然后,再分别尾静脉转输过表达Tim-4的巨噬细胞系和空载体对照细胞系。最后,用ConA诱发小鼠急性肝损伤,于不同时间点处死小鼠,通过检测小鼠血清ALT的水平、HE染色和TUNEL染色评价肝脏的损伤程度,以及用ELISA的方法来分析不同实验组小鼠血清中的TNF-α分泌情况。研究结果显示,RAW264.7-Tim-4细胞转输组小鼠血清ALT水平显著低于对照细胞转输组;HE染色结果以及TUNEL检测结果都表明,RAW264.7-Tim-4细胞转输组小鼠的肝脏损伤程度显著低于对照细胞转输组。另外发现RAW264.7-Tim-4细胞转输组血清中TNF-α水平有明显减低的趋势。以上结果表明,Tim-4过表达的小鼠巨噬细胞系RAW264.7-Tim-4可能通过抑制TNF-α的产生显著减轻ConA诱发的小鼠急性肝损伤。这与我们的体外研究结果一致。由于ConA诱发的小鼠急性肝损伤模型很好地模拟了人类病毒性肝炎、自身免疫性肝病等疾病,所以这也为Tim-4用于此类疾病的治疗提供了可能。然而,Tim-4分子抑制巨噬细胞功能的具体分子机制及信号传导通路还有待于进一步深入研究和探讨。脂肪性肝病(fatty liver disease,FLD)是由一种或者多种诱因引起的以肝脏脂类物质(一般是甘油三脂)蓄积为病理改变的肝脏疾病,是最常见的弥漫性肝病之一,特别是在酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝和HCV感染的慢性病毒性肝炎中。脂肪性肝病并不是一种良性的病变,而是脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌的前期病理改变。流行病学研究显示脂肪肝在我国的发病率是5.2%～11.4%,发病年龄呈现年轻化趋势。然而,脂肪肝的确切发病机制并不完全明了。近年来的研究表明,无论是酒精性脂肪肝还是非酒精性脂肪肝,其发病均受遗传因素与环境因素的双重影响,为一种常见的多基因遗传病。因此,易感基因的研究有助于阐明FLD的发病机制,有助于FLD的诊断和治疗。 TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)是1995年由Wiley发现并克隆的肿瘤坏死因子(TNF)家族新成员。近年来的研究表明,在HCV感染和酒精吸入后脂肪肝患者的肝脏中,TRAIL基因的表达均显著高于正常对照组;而且TRAIL表达的升高可增加HCV和酒精对肝脏造成损伤的敏感性。因此,TRAIL基因被认为是人类脂肪肝病可能的易感基因。本课题组前期研究发现,中国山东汉族人群TRAIL基因第五外显子3'-UTR区1525G/A、1595C/T多态位点与脂肪肝的发病密切相关。2004年,AlexandraWeber等人发现,在欧洲人群中TRAIL基因启动子区-707、-665、-621和-597位点存在单核苷酸多态性。因此本研究拟通过病例对照分析来探讨中国山东汉族人群TRAIL基因启动子区四个单核苷酸多态性与脂肪肝易感性之间的关系。本研究以明确诊断为脂肪肝的患者109例(非酒精性42例、酒精性67例),以及年龄与性别与病例组相匹配的132例正常对照个体作为研究对象。抽韧庵芫猜鲅?提取DNA,用聚合酶链-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析方法和四引物法聚合酶链(Tetra-primer ARMS-PCR)反应方法,对TRAIL基因启动子区的四个单核苷酸多态性位点——707C/T、-665T/C、-621C/T和-597A/G的基因型在中国山东汉族人群中进行了检测。四个位点均符合遗传平衡规律。聚合酶链-限制性片段长度多态性分析、四引物法聚合酶链反应分析以及测序结果都显示,-707C/T、-665T/C和-597A/G位点在中国山东汉族人群中均未检测到单核苷酸多态性;-621C/T位点在中国山东汉族人群中存在单核苷酸多态性,该位点CC/CT/TT基因型频率在非酒精性脂肪肝、酒精性脂肪肝以及正常对照组中分别为0.238/0.500/0.262、0.269/0.448/0.284和0.280/0.394/0.326,但经统计学分析,该位点的基因型频率和等位基因频率在三组之间均没有显著性差异(P＞0.05)。本研究结果表明,被检测的TRAIL基因启动子区的4个SNP位点与中国山东汉族人群脂肪肝的发病无明显的相关性。鉴于本研究所用病例数有限,将通过进一步扩大病例数和选取更多人群来探讨TRAIL基因启动子多态性在中国人群脂肪肝发生中的作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R575.1
【图文】：

小鼠,检测结果

图2:小鼠尾静脉注射ConA8h后，血清ALT检测结果Fig.2ThelevelofALTinserumatshafterConAinjeetionbyi.v

ELISA检测,小鼠

图5:小鼠尾静脉注射ConAlh后，ELISA检测血浆中TNF一a分泌水平Fig.5ThelevelofTNF一ainPlasmaatlhafterConAinjeetionbyELISA

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