非酒精性脂肪性肝病相关miRNA差异表达谱的初步分析和功能研究

发布时间：2020-07-02 16:36

【摘要】：背景非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)已成为全球最常见的慢性肝病,然而其确切发病机制仍未明确,非侵入性特异标记物仍未找到,特效药物仍未研发。研究表明,作为表观遗传学重要组成部分的miRNA在NAFLD发生发展、诊断及治疗中有着重要意义,特别是外泌体miRNA受到了磷脂双层结构保护而较游离miRNA稳定性更好,但迄今为止人血外泌体miRNA在NAFLD中差异表达谱及作用特点研究尚少。目的筛选NAFLD患者血清外泌体miRNA差异表达谱,研究脂肪肝患者血清外泌体与动物模型肝组织miRNA表达异同,并进行靶基因预测及生物信息学分析,初步探索miRNA在NAFLD发生发展、诊断及治疗中的意义。方法(1)各取4例人口学特征相近的中重度NAFLD和健康人血清行外泌体提取及鉴定,Illumina高通量测序筛选出miRNA差异表达谱,对差异表达最显著的4条miRNA按轻度NAFLD、中重度NAFLD和Control每组各20例行qRT-PCR验证。(2)高脂饲料(HFD)喂养C57 BL/6小鼠构建NAFLD动物模型,分别于4周、8周、12周留取HFD组和CTL组小鼠血和肝脏标本,行血生化、肝脏病理及以上4条miRNA相对表达量的检测。(3)对以上4条miRNA取TargetScan、miRanda、Mireap靶基因预测结果交集与miRTarBase数据库结果进行并集作为最终预测结果,并进行靶基因的GO(Gene Ontology)分析和基于KEGG的pathway富集分析。结果(1)初步筛选出NAFLD和Control具有显著性差异(P0.05)且差异表达在2倍以上血清外泌体miRNA共19条,其中上调8条,下调11条。(2)hsa-miR-122-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-197-3p 相对表达量:NAFLD 中重度组NAFLD轻度组Control 组;hsa-miR-483-3p 相对表达量:NAFLD 组(轻度/中重度)Control 组,NAFLD轻度组与中重度组间无显著性差异。(3)高脂饲料喂养8周小鼠部分肝细胞出现散在脂肪滴,喂养12周出现弥漫性脂肪变,呈以小泡性为主的混合性脂肪变性。(4)喂养12周时小鼠肝组织miRNA相对表达量:mmu-miR-122-5p(HFD组CTL组),mmu-miR-146b-5p(HFD 组CTL组),mmu-miR-483-3p 无显著性差异。(5)4条miRNA行靶基因预测共得到2623个靶基因;GO功能分析显示靶基因在分子功能、细胞组分、生物过程有广泛的注释;靶基因显著富集的pathway共84条,从20条与NAFLD最密切的通路中筛选出与至少10条通路都相关的靶基因共5个,即PIK3R2,AKT2,AKT3,MAPK1,NFKB1。结论(1)血清外泌体 hsa-miR-122-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-197-3p、hsa-miR-483-3p在鉴定NAFLD与健康人群中意义不同,均参与脂肪代谢和多种肝脏疾病的发生发展。(2)高脂饲料喂养C57BL/6小鼠12周可构建成熟的NAFLD模型。(3)mmu-miR-122-5p、mmu-miR-146b-5p在小鼠肝脏脂肪变性过程中可能起重要作用。(4)这4条miRNA有望作为无创诊断NAFLD的生物标志物和特异性治疗的新靶点。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575
【图文】：

米颗粒跟踪分析（ＮＴＡ）法进行外泌体粒径检测逡逑米颗粒跟踪分析（ＮＴＡ）结果显示：外泌体的浓度为３．２９ｅ＋００８邋ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／值为６７邋ｎｍ，平均粒径为８５．０６邋ｎｍ，ＳＤ为３６．８９邋ｎｍ，粒径在３０－１５０邋ｎｍ有颗粒的８８．６７％，符合外泌体的大小分布。见图２。逡逑８．０Ｅ＋０６邋■逡逑７．０Ｅ４０６邋？逦６７逡逑ｔ逦Ａ逡逑、？逦６．０Ｅ４Ｏ６邋＊逡逑ｉ逦５．０Ｅ４０６邋■逦｜｜逡逑Ｉ逡逑＾邋４．０Ｅ４Ｏ６邋■逡逑Ｉ逡逑Ｃ邋３．０Ｅ＋０６邋■逦Ｉ邋Ｉ逡逑ｌ逦＼逡逑§逦２．０Ｅ＋０６邋■逦（逦＼逡逑１．０Ｅ＋０６邋■逦Ｉ逡逑ＯＯＥ－＾Ｏ邋逦４逦Ｚ逦６逦＾逦ｈ逦５—逡逑＂

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