IL-10处理的树突状细胞分泌的exosomes对实验性大鼠肠炎的治疗作用

发布时间：2020-07-08 00:31

【摘要】：第一章IL-10处理的树突状细胞分泌的EXOSOMES的制备与鉴定目的探讨体外诱导和扩增大鼠骨髓来源树突状细胞,经IL-10处理后,分离纯化其分泌的exosomes(IL-10-EXO)的方法,并从形态学、分子表型和免疫学功能等方面对IL-10-EXO予以鉴定。方法无菌条件下获取Wistar大鼠骨髓前体细胞,在GM-CSF(5ng/ml)条件下进行体外诱导、扩增,隔日半量换液,第5天收获未成熟DC细胞(imDC),与IL-10(10ng/ml)共培养48h,获得IL-10处理的树突状细胞(IL-10-DC)。通过倒置显微镜观察其细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面分子表达情况。在此基础上,收集IL-10-DC培养上清,超速离心法分离获得IL-10-EXO,膜超滤离心法纯化除菌。透射电镜观察IL-10-Dex形态,流式细胞仪检测IL-10-Dex膜表面分子表达情况,混合淋巴细胞反应(MLR)进行IL-10-EXO功能学检测。结果电镜下观察IL-10-DC细胞表面可见细小树突状突起,呈现未成熟特征。流式细胞仪检测表明imDC低表达MHCII、CD80、CD86及CD40分子。超速离心IL-10-DC培养上清可分离获得IL-10-Dex。膜超滤离心纯化除菌后透射电镜下观察可见IL-10-EXO为直径介于50-100nm,具有典型脂质双分子层结构的小囊泡。流式细胞仪检测表明IL-10-EXO低表达MHCII分子,低表达或不表达CD80、CD86及CD40分子。MLR检测显示IL-10-EXO在imDC的辅助下刺激T淋巴细胞增殖的能力显著低于imDC分泌的exosomes(EXO)。结论本法是体外制备大鼠骨髓来源IL-10-DC分泌的exosomes的有效方法,获得的IL-10-EXO低表达MHCII、CD80、CD86及CD40分子,具有抑制炎症反应的作用。第二章IL-10处理的树突状细胞分泌的exosomes对TNBS联合酒精诱导实验性大鼠肠炎的治疗作用目的探讨IL-10处理的树突状细胞分泌的exosomes对TNBS酒精联合诱导的实验性大鼠肠炎的治疗作用,并尝试阐述其机制。方法雄性Wistar大鼠40只,分为4组,n=10,灌肠之前禁食2天,不禁水。A组对照组10只给予45%酒精灌肠;其它30只TNBS联合45%酒精灌肠3天后,按照下述不同处理方法分为3组:B组腹腔注射1ml生理盐水;C组腹腔注射含有10μg IL-10-EXO的1ml生理盐水;D组腹腔注射含有10μg EXO的1ml生理盐水。观察7天内的情况,第8天全部处死。记录统计肠炎活动度评分、结肠肉眼评分、结肠组织病理评分,检测结肠组织中的髓过氧化物酶(MPO)活性和细胞因子INF-γ、IL-2、TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-10等水平。结果A组大鼠肠炎症状持续时间短暂,很快自愈;C组大鼠肠炎活动度评分、结肠肉眼评分和结肠组织病理评分均较B、D两组有显著的降低,结肠组织中的MPO水平,促炎症因子INF-γ、IL-2、TNF-α的水平亦较低,抑炎症因子IL-10水平较高。结论TNBS联合酒精灌肠可以诱导出较理想的实验性大鼠肠炎;IL-10处理DC分泌的IL-10-EXO能有效抑制大鼠肠炎的炎症反应,降低Th1型细胞因子的表达水平,改善肠炎症状。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R574
【图文】：

形态图,光镜,形态,分支

结果1.光镜下imDC、IL-10-DC及mDC的形态学观察在培养过程中，每天在倒置显微镜下观察细胞的生长情况。如图1-1所示，培养第5天，imDC细胞集落明显增多、增大，呈团块状或葡萄串状。IL-10处理后，见IL-10-DC细胞呈圆形、均匀分布，树突状分支细小。LPS刺激成熟后，mDC细胞悬浮增多，树突状分支增加，变得更加粗大?

形态图,扫描电镜,形态,细胞表面

图1-1：光镜下观察imDC、IL-10-DC及mDC形态（×20）2.电镜下imDC、IL-10-DC及mDC形态学观察如图1-2所示，扫描电镜观察显示培养5天的imDC及IL-10-DC细胞表面可见23

流式细胞仪检测,表型,分子,表达水平

表达水平进一步降低，具有更强的诱导耐受、抑制炎症的能力。在本实验中，我们检测了mDC、imDC及IL-10-DC表面分子的表达水平。IL-10-DC细胞表面分子MHCⅡ、共刺激分子CD80、CD86、CD40的表达均较低，如图1-3所示，呈现典型的致耐受性DC的表型特征。25

【参考文献】