PACS-2表达动态变化在非酒精性脂肪性肝病的意义

发布时间：2020-07-08 08:17

【摘要】：非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外病毒、药物、酒精等因素，主要特征为肝细胞内的脂肪过度沉积，发生脂肪变性的病理综合征。NAFLD与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关，是获得性代谢应激性肝损伤相关疾病。NAFLD包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关肝纤维化等系列疾病谱。它的发病机制较为复杂，目前主要学说为“二次打击”理论[1]。现有研究和本课题组以往研究均提示内质网应激参与NAFLD发病过程，启动内质网应激的因素有很多,但相关调控机制尚不明确。此外，NAFLD病程进程中，肝细胞会发生凋亡等病理改变，其发生机制也不明确[2]。磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇选蛋白(Phosphofurin Acidic Cluster Sortingprotein，PACS)家族是多功能蛋白家族，其成员包括PACS-1和PACS-2[3]。PACS-1定位于高尔基体与内质网之间[4]，而PACS-2则定位于内质网与线粒体之间，分别参与调节相应细胞器的结构与功能联系[5]。其中，PACS-2定位于内质网线粒体相关膜(Mitochondria-Associated Membrane，MAM)，在调控细胞凋亡，钙粒子转运和脂质代谢与转运中发挥重要作用。然而，PACS-2在NAFLD发生发展中的表达及意义尚并不明确，因此我们研究了PACS-2在非酒精性脂肪性肝病中的表达变化，并初步探讨其可能作用。方法 1. HepG2肝细胞脂肪变模型使用a-MEM培养基(含10%胎牛血清)培养HepG2细胞至汇合度80%以上。建模前一天，换无胎牛血清培养基，培养过夜。对照组细胞：a-MEM加1%牛血清白蛋白(不含脂肪酸）培养基处理(0h组)。脂肪变细胞：a-MEM加1%牛血清白蛋白(不含脂肪酸）培养基处理，添加500μM/L(微摩尔/升)的软脂酸钠。脂肪变模型根据诱导时间分为4h,8h,12h和24h等时间点。采用油红O染色显示胞内脂滴，显微镜观察细胞脂肪变程度[1]。 2. NAFLD大鼠模型选用4周龄雄性SD大鼠42只(体重170 210g),随机分为基础饲料组(对照组)、高脂饲料组(模型组)，分别于喂养分别于4周,8周,12周,16周,20周，每个时相点各收集大鼠6只采集标本。大鼠称重并麻醉，留取肝组织标本，部分制成石蜡切片，行HE染色；部分-70℃储存用于western blot检测。 3. Real-time PCR试验 Real-time PCR检测脂肪变HepG2细胞中PACS-2及其所调控的相关分子的mRNA水平表达，包括葡萄糖调节蛋白78(Glucose Regulated Protein78, GRP78)、细胞凋亡标志蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2Associated X Protein，Bax)和含半胱氨酸的冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase3，Caspase-3)。 4. Western-blot试验 Western-blot检测脂肪变HepG2细胞和NAFLD大鼠肝组织中PACS-2、GRP78、Bax和Caspase-3的蛋白表达水平。 5.统计学分析利用SPSS软件13.0进行统计分析，以P0.05为差异显著，有统计学意义。结果 1.软脂酸诱导HepG2细胞发生脂肪变性我们采用油红O染色检测HepG2细胞脂肪变性程度。显微镜下观察发现，油红O染色使脂滴呈现为红色。软脂酸处理时间延长, HepG2细胞胞浆内脂滴明显增多,且脂滴呈现逐渐增大，相互融合的现象。这些结果表明，软脂酸处理HepG2细胞可以诱导肝细胞发生脂肪变性。 2.高脂饮食导致SD大鼠发生NAFLD 大鼠肝组织切片，HE染色发现，随着高脂饮食时间延长，大鼠肝组织逐渐出现脂肪变。随喂养时间延长，大鼠肝组织进行性加重，出现肝小叶内炎症及肝纤维化等病理改变。这些结果表明，高脂饮食成功建立了NAFLD大鼠模型。 3. Real-timePCR检测脂肪变HepG2细胞中PACS-2、GRP78、Bax和Caspase-3mRNA的表达水平 Real-timePCR检测发现，PACS-2mRNA相对表达量在细胞脂肪变性的早期下降(4h，P0.01；8h，P0.05)，而后期则显著增加(12h，P0.01；24h， P0.01)。细胞脂肪变性后12h和24h，GRP78、Bax和Caspase-3三者mRNA的相对表达量比未发生脂肪变性的细胞均显著升高(三者P0.01)。 4. Western-blot检测脂肪变HepG2细胞与NAFLD大鼠肝组织中PACS-2、GRP78、Bax和Caspase-3的蛋白表达变化 Western-blot检测表明，与未发生脂肪变性的细胞比，HepG2细胞脂肪变性4h后PACS-2表达显著下调(P0.01)，而脂肪变性12h和24h后则显著上升。此外，细胞脂肪变性后12h和24h，GRP78、Bax和Caspase-3三者表达量均显著上调(P0.01)。在高脂饮食诱导大鼠NAFLD过程中，早期(8w）PACS-2表达显著降低(P0.01)，而晚期(16W、20W)则显著上升(P0.01)。GRP78在早期(8w)即表现为显著上调(P0.01)，之后持续升高, Bax和Caspase-3则在晚期(16w、20w)才出现有显著上调(P0.01)。结论 1.无论在细胞模型或动物模型，肝细胞脂肪变性过程中PACS-2表达动态变化，规律是早期表达降低，后期表达升高；GRP78表达在早期即升高并持续高表达, Bax和Caspase-3则只有到后期才出现显著升高。 2.肝细胞脂肪变早期出现PACS-2低表达可能参与了NAFLD内质网应激反应，其在晚期升高可能与肝细胞凋亡所致肝损伤相关。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575.5
【图文】：

脂滴,油红

图 1-1 0hHepG2 细胞中未见明显脂滴。油红 O 染色 (x400)图 1-2 4h少数细胞胞浆内出现直径较小的脂滴。图 1-3 8h较多的细胞出现较多脂滴，在细胞内脂滴直径也较前有所增大。油红 O 染色 (x400)图 1-4 12h更多的细胞脂肪变，一些细胞中的脂滴增大，并相互融合。油红 O 染色 (x400)

脂滴,油红,直径

脂滴,油红,细胞内,细胞

图 1-3 8h较多的细胞出现较多脂滴，在细胞内脂滴直径也较前有所增大。油红 O 染色 (x400)图 1-4 12h更多的细胞脂肪变，一些细胞中的脂滴增大并相互融合。油红 O 染色 (x400)图 1-5 24h几乎所有细胞都有明显的脂滴，部分有融合。油红 O 染色 (x400)

【参考文献】