酵母双杂交筛选IRE1结合蛋白及其在肝细胞凋亡中的作用研究
发布时间：2020-07-11 01:21
【摘要】： 内质网跨膜蛋白需肌醇酶1(IRE1)是内质网应激(ER stress)的核心感受器,可感受内质网管腔内未折叠蛋白的聚集并将这种刺激传递至细胞其他区域。近年研究发现内质网应激与多种肝脏疾病有关,如病毒感染(乙肝、丙肝),糖尿病-肥胖症相关的肝脏疾病,酒精性肝病,α1-抗胰蛋白酶缺乏症及缺血再灌注损伤等。内质网应激引起的未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR)可通过诱导分子伴侣表达上调,关闭蛋白翻译等降低内质网蛋白负荷,但持续过强的内质网应激反应则导致细胞凋亡。为阐明内质网应激与肝细胞凋亡的关系,本研究通过酵母双杂交系统筛选与IRE1相互作用的蛋白质,为进一步探索内质网应激在肝脏疾病中的作用奠定基础。 1.酵母双杂交系统筛选IRE1相互作用蛋白质:采用酵母双杂交的方法,分别以hIRE1α(人IRE1α)N端段1～465位氨基酸及C端段468～977位氨基酸为诱饵,与人睾丸cDNA文库质粒顺序转化AH109酵母菌株,经三重/四重营养缺陷培养基及X-α-GAL半乳糖苷酶试验筛选,将PCR鉴定为阳性的酵母质粒转入大肠杆菌,提取质粒并测序,进行生物信息学分析。最后通过酵母回转杂交实验对获得的相互作用加以验证。结果:成功构建诱饵质粒pGBKT7-IRE1N及pGBKT7-IRE1C,并在酵母中正确表达融合蛋白,自激活检测及毒性检测均为阴性。分别筛选出8个及15个与IRE1相互作用的蛋白质;通过回转实验验证,确定了能与IRE1 C端段相互作用的蛋白质RACK1。RACK1是由SCOTIN基因编码的支架蛋白,可细胞内多种激酶相互作用,介导激酶与底物的结合。 2.验证IRE1与RACK1在哺乳动物细胞及体外的相互作用:(1)构建真核表达载体3XFLAG-IRE1C, GFPC3-RACK1,双酶切及测序鉴定正确,以GFPC3空载体作为对照,共同转染293T细胞,利用免疫共沉淀技术验证IRE1与RACK1在哺乳动物细胞中的相互作用。( 2 )构建原核表达载体pGEX-6p2-RACK1,pGEX-6p1-IRE1C,分别转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导融合蛋白表达并纯化,其中以precision酶切GST-RACK1融合蛋白,获得不带GST TAG的RACK1蛋白,与空GST蛋白为对照,分别与GST-IRE1C孵育,体外Pull-down实验验证IRE1与RACK1的相互作用。(3)构建真核表达质粒GFPC3-IRE1WT,转染人肝癌细胞系HepG2,同时以RACK1单抗及抗鼠-Rodamine为二抗进行免疫荧光实验,检测IRE1及RACK1在肝细胞中的定位。结果:通过体内及体外实验分别验证IRE1与RACK1相互作用的存在,且证明IRE1 C端为RACK1结合部位,免疫荧光证实IRE1与RACK1在肝细胞内有共定位,为其相互作用提供可靠依据。 3.RNA干扰实验探讨RACK1对IRE1功能的影响:(1)转染RACK1 SiRNA入HepG2细胞,48小时后收取细胞裂解液,进行Western blot验证基因敲除效果。给予敲除RACK1的细胞以内质网应激诱导药物衣霉素(Thapsigargin,TG)处理,通过western blot检测IRE1的磷酸化及其下游内质网分子伴侣GRP78的表达,同时应用RT-PCR检测XBP-1 mRNA的表达及其剪切,确定RACK1敲除对IRE1功能的影响。(2)相同方法敲除HepG2细胞中RACK1的表达,给予不同剂量的TG处理,TUNEL法检测RACK1敲除对内质网应激时肝细胞凋亡的影响。结果:成功敲除HepG2细胞中RACK1的表达,Western blot及RT-PCR证实RACK1敲除可抑制内质网应激时IRE1的功能活化,同时抑制内质网应激对肝细胞凋亡的诱导。 结论:本研究通过酵母双杂交系统首次发现IRE1与RACK1的相互作用,并通过体内、体外多种方法证实其相互作用的存在,最后通过RNA干扰及功能试验证实IRE1对ER stress的感受及活化,对分子伴侣的诱导及XBP-1的剪切,以及细胞凋亡的诱导,均依赖于RACK1的存在,提示RACK1是内质网应激反应信号通路中不可或缺的一个环节,与ER stress下肝细胞的凋亡密切相关,进一步的研究对内质网应激相关的肝脏疾病有重要意义。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R575
【图文】：
图 1 内质网跨膜信号蛋白及主要通路4. 内质网应激反应与细胞凋亡ESR 对 ER 稳态的重建体现了它的细胞保护作用，然而持续、过强的应激导致 ER 功能紊乱无法被纠正时，多细胞真核生物则启动凋亡信号，清除受损的细胞，防止应激损伤进一步扩大。内质网应激诱导的凋亡与传统的外源性/内源性凋亡通路均有交叉，且存在其特异性的凋亡信号传导途径，如 caspase-12，以下详述。4.1 内源性凋亡途径ER stress时内质网膜上的Bak及Bax构象发生改变并且/或二聚化导致ER 钙离子释放[85]。ER 钙库的波动导致胞浆内calpain的活化，进而切割pro-caspase-12 生成caspase-12。活化的caspase-12 通过caspase-9 及caspase-3[86-87]激活caspase cascade。这一通路与传统内源性凋亡途径的Apaf-1 及线粒体细胞色素c的释放无关，为ER stress特异的独立凋亡通
stress诱导凋亡有部分抵抗作用[90-91]，提示caspase-12 与chop介导ERstress特异性的细胞凋亡。ER stress时IRE1 的活化可募集TRAF2，而TRAF2 促进procasp se-12聚集a[92]，这是procaspase-12 活化必不可少的条件。ER stress上调procaspase-12 的 表 达 ， 实 验 证 实 ， caspase-12 过 表 达 可 活 化procaspase-12[93]。当procaspase-12 从胞浆转运至ER时，可被caspase-7活化。除此之外，定位于ER的酪氨酸激酶c-Abl在ER stress时可转运至线粒体，进而导致细胞色素C的释放。c-Abl缺陷型细胞的ER stress相关性细胞凋亡被减弱[94]。4.2 外源性凋亡途径在ER stress条件下，IRE1 与TRAF2 及ASK1 形成异源三聚体，进而活化c-Jun 氨基末端激酶（JNK），诱导细胞凋亡[95]。此外，JIK可与IRE1结合并促进TRAF2 的磷酸和及其与IRE1 的结合[96]。
图 2 IRE1 结构及诱饵质粒构建示意图2.2 诱饵蛋白转化酵母rid System 3 & Libraries UserManu 3p 培养基中扩增，后参照Yeas与自激活检测参照 Matchmaker GAL4 Two-Hybal(PT 247-1)，以 PEG/LiAc 法小规模转化诱饵质粒入 AH109 酵母菌株，转化产物涂于SD/-Trp/X-α-Gal平板，30 ℃倒置培养3-5 d,等待克隆长出，根据克隆的大小和颜色判断诱饵蛋白对酵母的毒性及自激活作用。2.3 酵母蛋白提取物的制备及Western blot检测挑取上述转化平板上的单个白色克隆于 SD/-Trt Protocols Handbook(Clontech PT3024-1)，使用尿素/SDS 法制备酵母蛋白提取物。将所提取的蛋白各取 30 μg，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜。转膜后丽春红染色 3 min 观察转膜效果。将转好的膜放入含有 5 mL/LTween-20 的 PBST 中，洗膜 5 min；然后封入含有 50 g/L 脱脂奶的暗盒中，室温缓慢摇动 60 min；PBST 洗膜 5 min×3 次，加入的按 1:2000 稀释于 PBST
本文编号：2749749
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R575
【图文】：
图 1 内质网跨膜信号蛋白及主要通路4. 内质网应激反应与细胞凋亡ESR 对 ER 稳态的重建体现了它的细胞保护作用，然而持续、过强的应激导致 ER 功能紊乱无法被纠正时，多细胞真核生物则启动凋亡信号，清除受损的细胞，防止应激损伤进一步扩大。内质网应激诱导的凋亡与传统的外源性/内源性凋亡通路均有交叉，且存在其特异性的凋亡信号传导途径，如 caspase-12，以下详述。4.1 内源性凋亡途径ER stress时内质网膜上的Bak及Bax构象发生改变并且/或二聚化导致ER 钙离子释放[85]。ER 钙库的波动导致胞浆内calpain的活化，进而切割pro-caspase-12 生成caspase-12。活化的caspase-12 通过caspase-9 及caspase-3[86-87]激活caspase cascade。这一通路与传统内源性凋亡途径的Apaf-1 及线粒体细胞色素c的释放无关，为ER stress特异的独立凋亡通
stress诱导凋亡有部分抵抗作用[90-91]，提示caspase-12 与chop介导ERstress特异性的细胞凋亡。ER stress时IRE1 的活化可募集TRAF2，而TRAF2 促进procasp se-12聚集a[92]，这是procaspase-12 活化必不可少的条件。ER stress上调procaspase-12 的 表 达 ， 实 验 证 实 ， caspase-12 过 表 达 可 活 化procaspase-12[93]。当procaspase-12 从胞浆转运至ER时，可被caspase-7活化。除此之外，定位于ER的酪氨酸激酶c-Abl在ER stress时可转运至线粒体，进而导致细胞色素C的释放。c-Abl缺陷型细胞的ER stress相关性细胞凋亡被减弱[94]。4.2 外源性凋亡途径在ER stress条件下，IRE1 与TRAF2 及ASK1 形成异源三聚体，进而活化c-Jun 氨基末端激酶（JNK），诱导细胞凋亡[95]。此外，JIK可与IRE1结合并促进TRAF2 的磷酸和及其与IRE1 的结合[96]。
图 2 IRE1 结构及诱饵质粒构建示意图2.2 诱饵蛋白转化酵母rid System 3 & Libraries UserManu 3p 培养基中扩增，后参照Yeas与自激活检测参照 Matchmaker GAL4 Two-Hybal(PT 247-1)，以 PEG/LiAc 法小规模转化诱饵质粒入 AH109 酵母菌株，转化产物涂于SD/-Trp/X-α-Gal平板，30 ℃倒置培养3-5 d,等待克隆长出，根据克隆的大小和颜色判断诱饵蛋白对酵母的毒性及自激活作用。2.3 酵母蛋白提取物的制备及Western blot检测挑取上述转化平板上的单个白色克隆于 SD/-Trt Protocols Handbook(Clontech PT3024-1)，使用尿素/SDS 法制备酵母蛋白提取物。将所提取的蛋白各取 30 μg，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜。转膜后丽春红染色 3 min 观察转膜效果。将转好的膜放入含有 5 mL/LTween-20 的 PBST 中，洗膜 5 min；然后封入含有 50 g/L 脱脂奶的暗盒中，室温缓慢摇动 60 min；PBST 洗膜 5 min×3 次，加入的按 1:2000 稀释于 PBST
【相似文献】
相关期刊论文 前1条
1 鲁芳;胡丽娟;刘德松;汪宇辉;刘彦友;甘露;薛建新;万朝敏;王正荣;;PER1与RACK1蛋白作用位点分析[J];四川大学学报(医学版);2007年04期
相关博士学位论文 前2条
1 胡丽娟;hPER1相互作用蛋白的筛选及与近日节律关系的研究[D];四川大学;2006年
2 张伟;文昌鱼几个发育相关基因的研究及三崎柱头虫的形态学观察[D];山东大学;2006年
相关硕士学位论文 前1条
1 鲁芳;PER1相互作用蛋白RACK1的近日节律相关基因[D];四川大学;2006年
本文编号：2749749
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/xiaohjib/2749749.html
最近更新
教材专著
