复制缺陷的HBV重组体对野毒株的抑制作用

发布时间：2020-07-11 02:34

【摘要】： 尽管有高效的疫苗进行预防,临床上也开始使用多种抗病毒药物如干扰素-α(IFN-α)及核苷类似物等进行治疗,但慢性乙型肝炎仍严重威胁着人们的健康。近年来基因治疗在抗HBV治疗方面取得了较大进展,如核酶、Dominantnegative突变体(DN突变体)和小干扰RNA(siRNA)等。本课题用腺病毒载体基因改造的类似方法重组HBV基因组,保留HBV的包装信号,在X基因翻译起始部位引入终止子以终止X蛋白的表达,全长的C基因与S基因融合使C-S融合蛋白取代包装所需的核衣壳蛋白和表面蛋白,在重组HBV基因组后通过内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site,IRES)连接了IL-2基因,构建了双表达载体。该重组HBV基因组利用HBV的天然嗜肝特性,在患者肝细胞内竞争性利用HBV野毒株的C蛋白和S蛋白包装病毒,将C、S蛋白融合产生的DN突变体的抗HBV作用在有野毒株存在的肝细胞内持续、放大作用;不表达X蛋白,消除了X蛋白的反式激活、损害宿主细胞的不利影响;并利用IRES同时表达IL-2以增强抗HBV的作用。一、基于腺病毒载体HBV复制缺陷重组体的构建以含1.3拷贝HBV野毒株基因组的质粒1.3 x wt HBV in pGEM3Z(p1.3HBV)为模板,分别以KpnⅠ/XbaⅠ、XbaⅠ/HindⅢ酶切并将酶切得到的2.4Kb、1.8Kb的HBV基因片断克隆至pUC19载体,使p1.3HBV含有的两个X基因克隆至pUC19载体,命名为2.4Kb/pUC19(还包含C基因和S基因的起始部分)和1.8Kb/pUC19。用定点突变试剂盒,设计引物使X基因的第8位氨基酸的密码子从CAA突变成终止密码子TAA。同样的方法,以2.4Kb/pUC19质粒为模板,以限制性内切酶MluⅠ位点(-ACGCGT-)取代C基因终止子密码子,且在S基因起始密码子前插入MluⅠ酶切位点。用MluⅠ单酶切该突变质粒以切除C基因末端与S基因起始密码子之间的序列,回收的大片断以T4连接酶连接产生CS融合基因。再次设计引物,删除C、S基因之间的MluⅠ酶切位点(-ACGCGT-),并将CS+X~-克隆到腺病毒载体PDC316上构建成CS+X~-/PDC316。二、CS+X~--IRES-IL-2/PDC316双表达重组体的构建以质粒IRES/pMD18-T为模板,设计引物经PCR反应在IRES基因片断两端引入SalⅠ酶切位点,克隆到载体pMD18-T。经酶切、测序鉴定后以SalⅠ单酶切质粒,将IRES克隆至PDC316质粒载体。以BamHI酶切IL-2/MNSM,将切下的IL-2基因定向克隆到IRES/PDC316质粒,构建了IRES-IL-2/PDC316质粒。以SalⅠ酶切IRES-IL-2/PDC316质粒,将IRES-IL-2基因片断定向克隆到CS+X~-/PDC316,构建了的CS+X~--IRES-IL-2/PDC316双表达质粒。三、复制缺陷的乙型肝炎病毒重组体抑制野毒株作用的体外研究将PCH3143质粒上的缺失包装信号的HBV基因组克隆至PDC316载体构建成辅助质粒3143/PDC16。应用脂质体将构建的CS+X~--IRES-IL-2/PDC316、CS+X~-/PDC316与辅助质粒3143/PDC16共转染HepG2细胞,并分别以质粒CS+X~--IRES-IL-2/PDC316、1.3HBV/PDC316、3143/PDC316单独转染为对照。转染后48小时,1)以MTT比色法检测转染质粒对细胞的毒性;2)以RT-PCR检测CS+X~--IRES-IL-2/PDC316转染后细胞内融合蛋白的表达,以双抗体夹心ELISA法检测培养上清中的IL-2;3)提取转染细胞培养上清中的病毒颗粒,以过量的DNaseⅠ消化过剩的转染质粒后进行PCR以检测上清中的HBV颗粒。结果证实:1)转染复制缺陷的HBV重组体对细胞无毒性作用;2)单独转染复制缺陷的HBV重组体可以在细胞内表达产生C-S融合蛋白,上清中的IL-2的表达量为(7.89±0.21ng/ml),但该重组体不能包装成病毒颗粒分泌至细胞上清中;3)复制缺陷的HBV基因组在HBV辅助质粒3143/PDC316的帮助下能有效复制并包装成子代病毒颗粒分泌到胞外。为观察复制缺陷的HBV重组体对野毒株的作用,将HepG2细胞分别用以下质粒或重组体进行共转染:1)CS+X~-/PDC316和野生型1.3倍HBV/PDC316质粒,2)CS+X~--IRES-IL-2/PDC316和野生型1.3倍HBV/PDC316,3)PDC316和野生型1.3倍HBV/PDC316。转染后48小时收集培养的细胞和上清进行用定量PCR进行HBV的定量检测检测。结果显示,三组细胞中的HBV定量分别为6.45×10~6copies/ml、5.75×10~6copies/ml和2.23×10~7copies/m,CS+X~-/PDC316、CS+X~--IRES-IL-2/PDC316对野毒株的抑制率分别为71.08%、75.29%,上清中的病毒定量分别为4.06×10~6copies/ml,5.06×10~6copies/ml和1.87×10~7copies/ml,CS+X~-/PDC316、CS+X~--IRES-IL-2/PDC316对野毒株的抑制率分别为74.20%、72.94%。这些结果表明,复制缺陷的HBV重组体在体外能有效抑制HBV野毒株的复制。结论: 本课题成功构建了一种全新的、基于腺病毒载体、能表达IL-2的复制缺陷HBV重组体。该重组体与包装信号序列缺失的辅助质粒PCH3143共转染HepG2细胞后可进行包装、复制,与HBV野毒株共转染HepG2细胞则可显著抑制HBV野毒株的复制。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R512.62
【图文】：

示意图,重组体,模板,结构示意图

组的基因长度与1.1拷贝和1.2拷贝类似，但复制效率高，是兼顾复制效率和克隆基因组大小的较为理想的克隆模板[43]。因此，本课题采用 PI.3HBv为模板。Fig.18为 PI.3HBv的结构示意图，Fig.19为其酶切示意图。R.3之2111 1.J、 111弓、4，奋sbp Fig.18pl.3HBV的结构示意图

细胞活性,细胞,和图

各组HePGZ细胞在不同时间点细胞活性从表1和图1可以看到，上述质粒转染对HePGZ的生长没有明显影响

琼脂糖电泳,产物,引物,PCR模板

突变株完全互补。PCR产物大小一致，即两者的PCR模板是一致的，PCR反应的条件、检测的灵敏度应该是一致的，可以互为对照，因此选用该引物作为扩增引物。常规PCR电泳结果见图6。 123452000bP 1000bP;}};l图6常规PCR产物琼脂糖电泳

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