【摘要】:目的:建立人脐血单个核细胞的体外培养系统,用HBV感染人脐血单个核细胞,了解HBV在人脐血单个核细胞内的复制、分泌过程,进而建立起人脐血单个核细胞作为HBV感染的细胞模型,为探讨和研究HBV宫内感染的分子机制及HBV垂直感染奠定基础。 方法:在大理学院附属医院妇产科收集脐血,用EDTA做抗凝剂,采用Ficoll密度梯度离心法分离得到人脐血单个核细胞,苔盼蓝染色结果表明活细胞比率达到98%。将脐血单个核细胞用RPMI1640培养液按照1×106/ml的密度接种在24孔细胞培养板中,在37℃、5%的CO2培养箱内培养,倒置显微镜观察细胞形态学的动态变化。用病毒颗粒与脐血单个核细胞比约为100:1进行感染。在HBV感染人脐血单个核细胞后继续培养15d,每天采用酶联免疫法(ELSIA)对细胞培养上清液检测乙肝病毒五项指标(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb),运用荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术对细胞培养上清液和细胞内的HBV DNA进行定量检测,确定HBV DNA感染的动态变化。结果:⑴脐血单个核细胞形态学的动态变化:脐血单个核细胞在培养15d内能维持正常的细胞形态与结构,绝大部分细胞悬浮生长,少量细胞贴壁生长。 ⑵ELSIA法检测培养细胞上清液中乙肝五项指标:培养细胞上清液在第1d,HBsAg表现为阳性,第2d转为阴性,随后细胞培养至第7~10d时,HBsAg再次出现阳性,之后又转为阴性,HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb在检测中,均出现阴性结果。 ⑶荧光定量PCR法检测HBV DNA:每天更换细胞培养液的细胞培养上清液中的HBV DNA第1d可以检出,第2~3d没有检测出,从第4天再次检测出,且HBV DNA的拷贝数逐渐升高,在第9d开始呈下降趋势,第13d已检测不出来,HBV DNA拷贝数的变化曲线接近呈倒“V”形;不更换细胞培养液的细胞培养上清液中的HBV DNA含量逐渐升高HBV DNA拷贝数的变化曲线呈“S”形;培养细胞中的HBV DNA在第1至第3d,细胞内并没有检测出HBV DNA,从第4d开始,可以检测得到HBV DNA,在第9d,细胞内HBV DNA的含量达到最大,随着细胞培养天数的增加,细胞内HBVDNA的含量逐渐降低。培养细胞中的HBV DNA的拷贝数变化曲线呈倒“V”形。 结论:⑴建立了人脐血单个核细胞的体外培养系统; ⑵人脐血单个核细胞可作为HBV感染的细胞模型; ⑶FQ-PCR法比ELSIA法能更好的确认标本中HBV存在。
【学位授予单位】:大理学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R512.62
【参考文献】
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本文编号:
2750952
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