miR-134在肝纤维化中的作用及其机制研究

发布时间：2020-07-12 06:30

【摘要】：【研究背景及目的】肝纤维化（hepatic fibrosis）是肝脏在持续的肝实质细胞破坏或慢性炎症等慢性损伤条件下发生的一种常见的修复过程，表现为富含胶原的细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）沉积过多而降解减少，最终导致肝组织疤痕形成及正常结构破坏。这一过程主要由肝脏内来源各异的肌成纤维细胞（myofibroblasts，MFs）驱动，而肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）是肌成纤维细胞最主要的来源之一。作为肝脏中最重要的间质细胞类型，静息的HSC（differentiated HSC）主要司职脂溶性维生素A的贮存。肝脏发生慢性损伤后，调控诸多激活因子如转化生长因子β（TGFβ）、血小板衍生生长因子（PDGF）和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）等的信号转导通路活化，氧化应激增多，促进静息的HSC向肌成纤维细胞转分化（myofibroblastictrans-differentiation），即发生活化，表现为储脂功能下降，获得增殖能力并产生大量胶原。鉴于HSC在肝纤维化发生中的重要地位，既往已利用抑制HSC活化或诱导其凋亡来治疗肝纤维化，但尚未取得令人满意的临床疗效。近年来关于肝纤维化的治疗出现了一些新的分子靶点，微小RNA（microRNA，miRNA）是其中的研究热点之一。miRNA是内源性非编码双链RNA，对基因表达发挥转录后调控作用。新近有诸多研究表明miRNA在病毒性肝炎、酒精性或非酒精性脂肪性肝病、肝纤维化和原发性肝细胞癌的病理过程中发挥重要作用。其中有研究表明miRNA在肝纤维化发生过程中存在异常表达，并可通过调控HSC的增殖和凋亡发挥促进或抑制肝纤维化的作用，提示通过外源性调控相关miRNA表达可能成为治疗肝纤维化的新手段。 miR-134位于Dlk1/Dio3印记基因区域内的miRNA簇中，该区域位于人14号染色体和小鼠12号染色体。既往研究表明miR-134主要参与中枢神经系统的发育过程。它可促进神经元发育、树突脊形成并调控突触可塑性，其表达异常与少突神经胶质瘤和胶质母细胞瘤等神经系统肿瘤的发生密切相关。新近有研究表明miR-134与同簇的一些miRNA在原发性肝细胞癌的发展过程中发挥重要作用。在肝纤维化和肝癌发生发展过程中失调的重要转录因子肝细胞核因子4α可通过调控miR-134抑制肝癌的恶性表型，提示miR-134在肝脏的病理生理过程中也可能扮演重要角色。但目前为止，关于miR-134在肝纤维化中的作用尚未见报道。因此，本课题旨在明确miR-134在肝纤维化发生中的作用，并初步探讨其作用机制。【实验方法】一、miR-134在大鼠肝纤维化模型组织和大鼠肝星状细胞中的表达 1、检测正常大鼠肝组织及大鼠肝纤维化模型肝组织中miR-134表达将18只雄性SD大鼠（180g-200g）随机分为3组，每组6只。第1组为正常对照组，第2组和第3组给予1%二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine, DMN）100μl/100g体重腹腔注射，每周连续注射3天。第2周处死第2组，第4周处死第3组，留取肝组织，real time RT-PCR分别检测miR-134表达，比较模型组肝组织与正常组肝组织表达差异。参照本实验室以往方法制备胆总管结扎（bile duct ligation，BDL）大鼠肝纤维化模型（n=24），其中6只仅开腹未予未予胆管结扎，即为假手术组，并在造模1周、2周以及3周后各处死6只大鼠。取相同部位肝组织，real time RT-PCR检测miR-134表达，比较各组表达差异。 2、比较大鼠原代肝星状细胞静息状态和活化后miR-134的差异表达分离正常大鼠原代肝星状细胞，在体外予DMEM培液培养。收取体外培养后第3天（静息）、第6天、第9天和第12天细胞的RNA，realtime RT-PCR法检测各组细胞miR-134以及HSC活化标志物α平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）和I型胶原（collagen I）mRNA表达。 3、检测并比较TGFβ1刺激前后miR-134的差异表达用不同浓度的TGFβ1（0ng/ml、2ng/ml和4ng/ml）处理大鼠肝星状细胞株T6细胞，抽取处理48小时后的细胞RNA，real time RT-PCR法检测各组细胞miR-134以及HSC活化标志物α-SMA和collagen I mRNA表达。二、体外调控miR-134表达对T6细胞生物学特性的影响 1、上调miR-134表达对T6细胞生物学特性的影响用lipofectamine2000将大鼠miR-134拟似物（miR-134mimic）转染至T6细胞，转染48小时后抽取细胞RNA和蛋白，real time RT-PCR检测miR-134及HSC活化标志物α-SMA和Collagen I mRNA的表达；western blot法检测α-SMA和Collagen I蛋白表达。利用细胞计数试剂盒（cell counting kit8，CCK8）检测细胞数量，绘制生长曲线，观察上调miR-134对HSC增殖能力的影响。 2、抑制miR-134作用对T6细胞生物学特性的影响用lipofectamine2000将2′-甲氧修饰的大鼠miR-134互补链（miR-134inhibitor）转染至T6细胞中，real time RT-PCR鉴定转染48小时后HSC活化标志物α-SMA和Collagen I mRNA表达，western blot法检测其蛋白表达。同时利用CCK8法检测定转染miR-134inhibitor对HSC增殖能力的影响。三、初步探讨miR-134在肝纤维化中的作用机制 1、通过软件预测miR-134潜在靶基因利用TargetScan（www.targetscan.org）软件预测miR-134靶基因，发现信号转导及转录激活因子5b（Signal transducers and activators of transcription5B，STAT5B）为其潜在靶基因。检测T6细胞转染miR-134mimic或inhibitor后STAT5B的mRNA和蛋白表达。 2、验证miR-134对STAT5B的靶向调控作用构建含有miR-134在STAT5B3′-UTR结合位点的荧光素酶报告基因载体以及该位点突变的报告基因，与miR-134mimic或阴性对照NC共转染至HEK-293细胞，检测报告基因质粒荧光素酶活性，验证STAT5B是否为miR-134的靶基因。利用realtime RT-PCR法检测TGFβ1刺激T6细胞后STAT5B mRNA的表达，并分析其与miR-134表达的关系，进一步明确miR-134与STAT5B的关系。四、统计学处理所有实验至少重复3次。数据以X±SD表示，用SPSS11.0统计软件进行方差分析。多组间采用One-WayANOVA分析，方差非齐性则采用非参数检验。分别计算P值，P 0.05为具有显著性差异，P 0.01为具有非常显著性差异。【实验结果】一、miR-134在大鼠肝纤维化模型肝组织和活化的大鼠肝星状细胞中表达下调 1、与正常大鼠肝组织相比，大鼠DMN及BDL肝纤维化模型肝组织中miR-134表达下调 real time RT-PCR检测结果显示，与正常大鼠肝组织相比，DMN肝纤维化模型组大鼠肝组织中miR-134表达逐渐下调（P 0.05）。与假手术组大鼠肝组织相比，BDL模型组肝组织随时间延长miR-134的表达逐渐下降（P 0.05）。 2、大鼠原代肝星状细胞在体外培养后活化且miR-134表达下调 real time RT-PCR结果显示，大鼠原代肝星状细胞在体外培养6天后α-SMA和Collagen I表达开始上调，miR-134表达开始下降，此后随时间延长，α-SMA和CollagenI表达逐渐上调，miR-134表达逐渐下降。 3、TGFβ1刺激T6细胞后miR-134表达下调用不同浓度的TGFβ1刺激大鼠T6细胞48小时，real time RT-PCR结果显示，TGFβ1处理后α-SMA和Collagen I表达显著上调，提示T6细胞进一步活化，而miR-134表达显著下调，且呈浓度依赖性。二、miR-134可抑制T6细胞增殖及胶原等指标表达 1、上调miR-134表达可抑制T6细胞生物学特性T6细胞转染miR-134mimic及对照NC48小时后，real time RT-PCR结果显示与NC相比，miR-134mimic组α-SMA以及Collagen I的mRNA表达显著下调；westernblot结果显示二者的蛋白表达亦显著减少。生长曲线结果显示miR-134mimic可显著抑制T6细胞的增殖能力。 2、抑制miR-134活性后T6细胞胶原表达增加，增殖加快 T6细胞转染miR-134inhibitor及对照inhibitor NC48小时后，real time RT-PCR结果显示与inhibitor NC相比，miR-134inhibitor组α-SMA以及Collagen I的mRNA表达显著上调；western blot结果显示二者的蛋白表达亦显著增加。生长曲线结果显示miR-134inhibitor可显著提高T6细胞的增殖能力。三、miR-134在星状细胞中靶向调控STAT5B 1、miR-134调控STAT5B的表达real time RT-PCR结果显示转染miR-134mimic后STAT5B mRNA表达下调，转染miR-134inhibitor后， mRNA表达上调；western blot结果显示转染miR-134mimic后STAT5B蛋白表达下调，转染miR-134inhibitor后，STAT5B蛋白表达上调。 2、STAT5B是miR-134的直接靶基因含有miR-134在STAT5B3′-UTR结合位点的荧光素酶报告基因载体（野生型）以及该位点突变的报告基因（突变型）与miR-134mimic或阴性对照NC共转染至HEK-293细胞，双报告基因试剂盒检测结果显示miR-134mimic可降低野生型报告基因的荧光活性，而对突变型报告基因的活性无影响。TGFβ1刺激T6细胞后STAT5BmRNA的表达上调，与miR-134表达呈相反趋势，进一步说明miR-134调控STAT5B。【结论】一、miR-134随肝星状细胞活化和肝纤维化模型进展表达逐渐减少，提示其与肝纤维化发生发展密切相关。二、miR-134可抑制肝星状细胞株胶原表达和增殖能力。三、miR-134在星状细胞中靶向调控STAT5B表达，可能为其作用的分子机制。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.2
【图文】：

肝组织,表达水平,食欲,肝纤维化

型组大鼠逐渐出现脱毛现象，毛发凌乱无光泽，食欲差，活动量少，精神萎靡，界刺激反应慢。（二）BDL 诱导肝纤维化动物模型的建立6 只假手术对照组大鼠精神饱满，毛发亮泽，食欲佳，活动灵敏。18 只 BDL组大鼠毛发发黄，精神萎靡，食欲差，活动少。（三）miR-134 在肝纤维化的大鼠肝组织中表达下调取肝纤维化模型组大鼠和对照大鼠肝组织，抽提 RNA，real time RT-PCR 结果在 BDL 模型中，随着肝纤维化的发展，miR-134 的表达明显下降，BDL 模型 we较假手术对照组下调 76%；DMN 模型组中 miR-134 的表达也随肝纤维化的发展步下降，DMN 模型 week4 组较对照组下调 71%（图 1-1），提示 miR-134 与肝纤发生发展关系密切。

体外培养,大鼠,肝星状细胞,肝纤维化

miR-134 在肝纤维化中的作用及其机制二、大鼠原代肝星状细胞体外培养后 miR-134 表达的变化（一）大鼠原代 HSC 体外培养后 HSC 活化标志物的表达原代大鼠 HSC 分离后于体外培养，镜下观察 HSC 由多角形逐渐向肌成纤维胞方向发展，real time RT-PCR 结果显示活化标志物 α-SMA 和 collagen I 的表间延长逐渐上调，提示原代 HSC 体外培养过程中逐渐自发活化（图 1-2）。

体外培养

胞活化后 α-SMA（A）和 Collagen I（B）的表代 HSC 体外培养过程中 miR-134 表达逐养后第3天，第6天、第9以及第12天抽提RNA后第 6 天，miR-134 表达开始明显下降，此后相比 miR-134 表达下降 65%（p < 0.01）（图 1程密切相关。

【共引文献】