热休克蛋白HSP70在萎缩性胃炎的表达及其作用机制研究

发布时间：2020-07-15 15:20

【摘要】： 胃癌仍然是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一。最新报道指出每年新增胃癌病例870，000例，而死亡病例650，000例，占据肿瘤死因的第二位。由于缺乏有效的早期诊断方法，进展期胃癌病人的5年存活率仅有20％左右。国内外均有学者提出，能否在胃癌前疾病阶段就予以干预逆转治疗，即Ⅰ级预防胃癌的发生。因此深入了解胃癌前病变，有可能为胃癌的Ⅰ级预防提供科学依据。 慢性萎缩性胃炎是我国常见的慢性胃黏膜病变，其组织学特点表现为胃黏膜的慢性炎症和胃腺体细胞的丢失，并伴随肠上皮化生或纤维组织增生。目前普遍认为萎缩性胃炎与肠型胃癌关系密切，癌变概率可达1-7.46％，WHO已将其定义为胃癌前疾病。 幽门螺杆菌作为Ⅰ类致癌源，是目前最为明确的萎缩性胃炎致病因子，它可以通过诱导萎缩性胃炎而促进胃癌的发生。幽门螺杆菌导致的萎缩性胃炎的发生除了与感染菌株和感染对象所处的外界因素有关，还主要与宿主的内在因素如基因易感性、细胞应激反应状态等有关。 目前国内外有关萎缩性胃炎的发病机制研究很少，深入探讨萎缩性胃炎分子机制，考虑如何调动机体细胞自身的适应性保护机制以减少细胞损伤，正逐渐成为萎缩性胃炎等癌前疾病防治的重要课题。 热休克蛋白70(Heat shock protein 70，HSP70)是生物进化过程中高度保守的应激反应蛋白，当组织或细胞遭受各种刺激损害时，HSP70作为细胞内分子伴侣，能结合新生或未折叠蛋白，稳定或辅助其正确的空间构象；能结合变性蛋白，促进其降解；还能调节细胞免疫系统，维持细胞的完整性。此外，HSP70还是重要的增殖与凋亡平衡的调节蛋白。近年来，在一些胃黏膜病变(如胃溃疡、门脉高压性胃病、慢性胃炎等)的损伤修复研究中发现，诱导HSP70表达能增强胃黏膜细胞对各种损伤刺激的抵抗力，并促进细胞的增殖修复，提示HSP70对胃黏膜细胞具有保护作用。 萎缩性胃炎是各种损伤刺激长期作用于胃黏膜所致结果，但目前对于应激反应蛋白HSP70在萎缩性胃炎中的表达变化及其对胃黏膜细胞的具体作用机制尚不明确。本课题拟通过对萎缩性胃炎患者胃黏膜的检测，了解HSP70表达状态，并采用现代细胞与分子生物学技术，通过建立实验性大鼠萎缩性胃炎模型及体外幽门螺杆菌感染胃黏膜上皮细胞模型等途径来研究HSP70对萎缩性胃炎的作用、影响及机制，为萎缩性胃炎的防治提供科学依据和寻求可行的靶向目标。 一．材料和方法： 1．收集萎缩性胃炎病人的胃镜活检标本，分别以免疫组化、Westsrn blot来定性定量检测HSP70表达情况，单因素及多因线性回归分析萎缩性胃炎与HSP70的相关性。 2．按“姒氏造模法”建立大鼠慢性萎缩性胃炎模型。成模后，参照1994年美国休斯顿胃炎诊断标准，分别观察各组大鼠胃窦黏膜病理变化，定量分析胃窦腺体层厚度，单位长度内的腺体个数、炎症指数等指标，以免疫组化和Western blot评价HSP70表达，并分别给予HSP70诱导剂戊四烯酮(geranylgeranylacetone，GGA)、HSP70抑制剂栎精及相应溶剂二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)灌胃处理4周。以证实HSP70水平与萎缩性胃炎形成的相关性。 3．用不同浓度栎精抑制胃黏膜细胞AGS的HSP70表达，观察细胞活力和细胞周期变化，检测细胞凋亡和Bax、Bcl-2、AIF、clcaved caspase-3等凋亡蛋白表达的情况。以HSP70siRNA表达载体转染AGs细胞，并利用G418筛选稳定转染细胞株，通过小RNA干扰技术，观察HSP70对细胞增殖和凋亡的调节作用。 4．将幽门螺杆菌(ATCC700392)与HSP70siRNA转染细胞株或空载体对照细胞株共培养，观察HSP70表达抑制的胃黏膜细胞在模拟幽门螺杆菌感染状态下的细胞活力和细胞增殖周期改变，并检测Bax、Cyto c、caspase-3、caspase-6、caspase-7和AIF的表达情况；并将外源重组HSP70蛋白(50ng／ml)加入稳定转染细胞与幽门螺杆菌的共培养液中，对比检测Bax、细胞色素c、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7和AIF等凋亡蛋白的表达变化。 二、主要结果： 1．萎缩性胃炎病人胃黏膜HSP70表达较正常对照组减少，尤以轻、中度萎缩黏膜HSP70表达减少更为明显。 2．成功建立大鼠萎缩性胃炎模型，可见局部淋巴细胞和浆细胞浸润，胃窦腺体排列紊乱、稀疏，腺体层变薄，HSP70表达较正常对照减少；GGA诱导胃黏膜组织HSP70表达增强，并对大鼠萎缩性胃炎有保护和治疗作用，表现为萎缩性胃炎的胃黏膜炎症情况明显好转，腺体层增厚，腺体排列较整齐紧密；而栎精抑制胃黏膜细胞HSP70表达同时进一步加重炎症细胞浸润，胃黏膜充血水肿明显，腺体层薄而稀疏、排列紊乱。 3．栎精抑制体外胃黏膜细胞模型AGS的HSP70表达，抑制作用呈剂量依赖性；伴随着HSP70表达的逐渐减少，胃黏膜细胞活力也逐渐受抑，并诱导细胞周期S期阻滞和细胞凋亡增加；凋亡相关蛋白Bax，cleaved caspase-3和AIF表达上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达减少。 4．HSP70siRNA质粒表达载体体外稳定转染AGS细胞后，HSP70表达较对照细胞明显下调；细胞生长延缓，S期细胞所占比例增加，凋亡相关蛋白Bax、AIF和胞浆Cyto c表达上调。 5．幽门螺杆菌与胃黏膜细胞共培养呈现早期促增殖和后期抑制的明显作用；但下调HSP70表达使幽门螺杆菌对胃黏膜细胞生长活力抑制作用更加显著；HSP70siRNA转染细胞在幽门螺杆菌作用下，与空载体转染细胞比较，S期细胞积聚增加，凋亡较明显，并伴随线粒体内Cyto c含量减少，胞浆内Cyto c增加，AIF表达上调，Caspase-3前体蛋白表达减少；加入外源重组HSP70后线粒体Cytoc的释放显著减少，并进一步诱导AIF蛋白表达。 三、结论 1．临床和实验动物证实萎缩性胃炎HSP70表达减少；HSP70诱导剂-GGA能促进大鼠萎缩性胃炎胃黏膜细胞的修复，减轻炎症细胞的浸润；而HSP70抑制剂-栎精则加重了黏膜炎症情况，这些发现强烈提示HSP70与萎缩性胃炎的发生发展有关。 2栎精抑制体外胃黏膜细胞模型AGS的HSP70表达并显著抑制细胞活力，表现为细胞周期的S期阻滞和细胞凋亡增加，线粒体凋亡通路相关蛋白Bax、AIF、cleaved caspase-3和Bcl-2的表达变化进一步提示HSP70减少将促进萎缩性胃炎的发展。参与机制可能与HSP70调节胃黏膜细胞增殖及凋亡作用有关。 3．成功建立和筛选体外稳定转染HSP70siRNA的胃黏膜AGS细胞株，可见该细胞HSP70表达明显减少，细胞生长延缓，细胞周期呈S期阻滞，细胞凋亡蛋白Bax、AIF和胞浆Cyto c增加，提示HSP70siRNA转染会显著削弱细胞自稳调节能力，内源HSP70对维持细胞正常的生长和凋亡有重要作用，通过调节细胞增殖和凋亡平衡发挥其在损伤中的保护作用。。 4．幽门螺杆菌对胃黏膜AGS细胞有明显的早期促增殖和后期抑制作用；这种作用不依赖于HSP70表达的高低，但抑制AGS细胞HSP70表达会进一步促进幽门螺杆菌诱导的细胞凋亡发生，表明幽门螺杆菌与HSP在萎缩性胃炎发病中可能是二个独立的相关因素。HSP70可以通过对细胞周期及线粒体凋亡通路蛋白的调节拮抗H．pylori诱导的细胞生长抑制作用。 5．寻求可靠、安全的提高内源性HSP70保护水平的方法，结合根除幽门螺杆菌等抗损伤疗法可能是治疗萎缩性胃炎减少胃癌发生的有效途径。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R573.3
【图文】：

HSP70在所有标本中均有阳性表达.阳性细胞表现为棕褐色阳性颗粒弥散分布于细胞浆和部分细胞核中，主要分布在固有层内腺体细胞和部分的腺上皮细胞及少量的间质细胞内(图1.1)。图1.1胃私膜标本HSP7O分布:a.姜缩性胃炎;b.正常对照(marker:Ilnm)25

三.胃私膜组织HSP70的表达变化 we5ternbl。t单因分析结果发现，萎缩性胃炎病人胃私膜HSP70表达较正常对照减少(只0.05， Wi1ooxon检验)(图1.2);将萎缩性胃炎病人按不同萎缩程度分组，可见轻、中度姜缩的胃私膜HSP70表达有逐渐降低趋势;中度姜缩时HSP70表达最低，与对照组比较有显著统计学差异(只0.05， WiIcoxon检验)，而重度姜缩时HSP70表达增加，但与各组比较未见明显统计学差异(图1.3)。将萎缩性胃炎病人按不同肠化程度进行分组后发现，与正常对照比较，各肠化组胃私膜HSP70表达均有减少，其中轻度肠化组HSP70减少有统计学意义(只0.05

将萎缩性胃炎病人按不同肠化程度进行分组后发现，与正常对照比较，各肠化组胃私膜HSP70表达均有减少，其中轻度肠化组HSP70减少有统计学意义(只0.05，wil。oxon检验);而肠化各组之间比较没有显著性差异(图1.4)。H.pyl。ri感染一定程度上抑制了HSP70表达，但未见显著统计学差异。曰S户70aCtinO卜几仍工

本文编号：2756663