永生化成人肝细胞的构建及生物学特性初步研究

发布时间：2020-07-15 18:09

【摘要】： 肝功能衰竭是各种严重肝病的终末期表现,是威胁人类健康的重要原因之一,虽然原位肝移植是目前治疗肝细胞衰竭的最有效手段,但却受到捐献器官短缺和手术费用较高的限制,而建立有效的人工肝治疗,一方面可以为寻求合适的肝移植供体提供时间,另一方面可以为肝细胞再生争取时间。目前各种物理型人工肝辅助治疗系统虽然有不错的疗效,但仍无法替代肝脏的各种复杂生物学功能。随着细胞生物学和组织工程学的发展,体外生物人工肝支持系统(extracorporeal bioartificial liver support system,EBLSS)在肝功能衰竭治疗方面的应用,正日益受到人们的关注。原代人肝细胞无疑是体外生物人工肝支持系统的治疗最为理想的肝细胞来源,但原代人肝细胞,增殖传代极为困难;动物源性肝细胞虽可大量获得,却有着极大的风险,包括使病人出现人畜共患疾病(如使用猪肝细胞治疗有潜在的感染猪内生逆转录病毒的可能)以及异种蛋白进入病人体内导致免疫反应等风险,因此合适的肝细胞来源问题仍是制约生物人工肝发展的一个瓶颈问题。目前,通过永生化的方法设计建立能无限增殖并具有良好生物代谢功能的人源性肝细胞系是解决肝细胞来源问题的主要研究方向之一。 本课题通过将hTERT基因导入成人肝细胞HL-7702,构建了永生化成人肝细胞系(pLN/HL-7702),并且对导入hTERT基因前后两种细胞的形态、增殖状况、生物学功能进行了比较和研究,对新建永生化成人肝细胞系(pLN/HL-7702)致瘤性问题进行了初步研究,以期为进一步研究解决生物人工肝细胞来源问题奠定试验基础。 研究将携带有hTERT基因的逆转录病毒载体导入成人肝细胞HL-7702,通过RT-PCR,western-blot,和IEA(间接免疫荧光法)在基因和蛋白水平对所建细胞系(pLN/HL-7702)进行了鉴定;在倒置相差显微镜和透射电镜下观察并比较了基因导入前后细胞的形态及超微结构;采用MTT染色法检测在基因导入前后肝细胞的增殖能力变化,连续观察并描绘生长曲线;采用RT-PCR法检测基因导入前后肝细胞功能基因表达情况;采用western-blot检测基因导入前后肝细胞细胞色素P450的表达;并通过软琼脂实验、裸鼠致瘤性实验对所建细胞系pLN/HL-7702的致瘤性进行了初步分析。 结果:1.RT-PCR、western-bolt和IEA可检测到hTERT基因在肝细胞内转录和表达,可检测到相关蛋白;2.光镜和电镜观察细胞形态和超微结构未发现基因导入前后肝细胞的差异;3.细胞增殖实验表明细胞在导入基因后增殖能力有了明显的提高;4.肝细胞功能基因的转录在转染前后均可检测到;5.基因导入前后细胞上清的检测表明肝细胞的一般生化功能未受影响;6.基因导入前后肝细胞通过western-bolt均可检测到细胞色素P450的表达;7.软琼脂实验、裸鼠致瘤性实验未提示pLN/HL-7702有致瘤性表现。 讨论:本研究成功建立永生化成人肝细胞系pLN/HL-7702,其体外增殖能力较原细胞系HL-7702明显提高,在形态、结构及生物学功能方面与基因导入前无明显差异,并可检测到细胞色素P450的表达,初步致瘤性分析未发现细胞有致瘤性,提示该细胞系进一步研究后有可能为生物人工肝的治疗提供一种安全有效的肝细胞来源。
【学位授予单位】：中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R575.3;R318
【图文】：

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本文编号：2756836