抗菌肽对D-氨基半乳糖联合内毒素诱导小鼠急性肝衰竭保护作用的研究

发布时间：2020-07-17 14:45

【摘要】：研究背景及目的肝衰竭是由多种因素引起的肝脏合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍，导致肝脏功能严重失代偿，出现以黄疸、凝血机制障碍、肝性脑病以及腹水等为主要表现的一组临床症候群。肝衰竭发病急、进展快、并发症多、预后差、死亡率高。目前，尽管原位肝脏移植和人工肝支持治疗可作为肝功能衰竭治疗的有效手段，但前者供体肝缺乏，且存在手术复杂、术后可能发生排斥反应等缺点，使得这一治疗措施难以广泛推广；后者也面临血浆来源紧张，对晚期肝功能衰竭治疗效果差等问题。寻找新的肝衰竭治疗手段势在必行。以肠源性内毒素血症为核心的继发性肝脏损伤是导致肝衰竭病情迅速进展的重要原因。因此，探寻以中和内毒素为目标的治疗手段。以阻断肝衰竭患者内毒素血症导致的继发打击成为目前肝衰竭研究的热点。阳离子抗菌肽（cationicantimicrobial peptides,AMPs）是一类带净正电荷的两性小分子多肽，在生物体内广泛存在。研究发现，AMPs具有强大的中和内毒素的能力，并因此抑制炎症因子的释放。基于此，本研究通过体外实验及小鼠肝衰竭动物模型探讨AMPs治疗肝衰竭的可行性。方法我们首先在体外研究不同AMPs中和内毒素的效率，用鲎试验（LALassay）检测四种AMPs（PY、Ts、LL-37、Th）中和内毒素作用；采用CCK-8法检测四种AMPs对RAW264.7的毒性作用；用体外溶血实验评价四种AMPs的溶血活性；流式细胞技术检测AMPs对肝细胞凋亡率的影响；构建D-氨基半乳糖联合内毒素诱导小鼠急性肝衰竭模型，观察AMPs对模型小鼠存活率的影响，观察各组肝脏病理学变化，并通过免疫组化、Western blot检测其肝组织中凋亡相关蛋白Caspase-3的表达。结果1.中和内毒素作用：PY、Ts、LL-37、Th均有较强的中和内毒素作用，并且有一定的剂量关系，随着AMPs浓度的升高，中和率也明显升高；PY及LL-37有更强的中和能力；进一步组间比较，四种AMPs不同浓度间存在差异（P0.05），且四种AMPs分别在1、10、100umol/L中任意一个浓度比较，差异均有统计学意义（P0.05）。 2.细胞毒性研究：Ts、Th均有微弱的细胞毒性，且没有呈现明显的剂量关系。LL-37有一定的剂量关系，只有在相对较高的浓度(100umol/L)才表现明显的细胞毒性。PY对细胞的毒性有明显地剂量依赖性，在高浓度（40umol/L）时，有较强的细胞毒性，而在低浓度时只有较弱的细胞毒性。在浓度低于10umol/L时，四组均有较高的细胞存活率。进一步组间比较，PY、Ts、LL-37、Th不同浓度间存在差异，且差异有统计学意义（P0.05），且随着浓度的降低，AMPs的细胞毒性逐步降低；四种AMPs在任意一个浓度比较，差异均有统计学意义（P0.05）。 3.溶血活性研究：四种AMPs浓度低于40umol/L时，均表现轻微的溶血活性，在相对较高的浓度(80umol/L)，PY、Th、Ts仍表现微弱的溶血活性，而LL-37则表现明显的溶血活性，进一步组间比较，四种AMPs在不同浓度间存在差异，且差异有统计学意义（P0.05），且随着浓度的降低，AMPs的溶血活性逐步降低；四种AMPs分别在任意一个浓度比较，差异均有统计学意义（P0.05）。 4.对小鼠原代肝细胞凋亡的保护作用：与阳性对照组相比，四种AMPs均对肝细胞凋亡有抑制作用，其中PY的抑制作用最为明显；四种AMPs分别与阳性对照组比较，差异均有统计学意义（P0.05）；相同浓度四种AMPs对细胞凋亡的抑制能力为：PYLL-37TsTh；Ts、Th、LL-37的细胞凋亡率均为在80umol/L时更低；而PY在40umol/L时细胞凋亡率更低。 5.小鼠肝衰竭模型存活率的研究：PY、Ts、LL-37、Th对肝衰竭模型小鼠存活率有一定影响，且存在剂量关系；中等剂量的PY、LL-37（PY3、LL-373）小鼠的存活率较高；Ts、Th在1.5-6mg/kg范围内，随剂量升高，存活率升高。 6.组织学检测：HE染色：各组AMPs分别与对照组比较，肝组织损伤程度：PY1.5对照组PY6PY3；免疫组化法检测肝组织Caspase-3（激活型）表达显示：Caspase-3在正常肝组织不表达或少量表达，对照组表达明显升高；Caspase-3表达程度：PY1.5对照组PY6PY3正常组。 7. Western blot：Caspase-3表达面积灰度比值为：PY1.5对照组PY6PY3正常组；组间两两比较，正常组、PY3、PY6分别与对照组之间存在差异，且差异有统计学意义（p0.05）；PY1.5与PY3、PY6之间存在差异，且差异有统计学意义（p0.05）。结论本文通过体外实验比较PY、Ts、LL-37、Th四种AMPs中和内毒素作用、细胞毒性、溶血活性及对LPS诱导小鼠原代肝细胞凋亡的抑制作用，发现PY具有中和内毒素能力强且毒副作用低等优势。进一步研究PY对D-氨基半乳糖联合内毒素诱导小鼠急性肝衰竭模型的保护作用，发现特定剂量PY可以显著改善肝衰竭小鼠肝脏组织学表现，抑制凋亡相关蛋白Caspase-3的表达并显著增加小鼠存活率。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.3
【图文】：

小鼠,保护作用,存活率,急性肝衰竭

抗菌肽对 D-氨基半乳糖联合内毒素诱导小鼠急性肝衰竭保护作用的研究第二部分结果（一）AMPs 对急性肝衰竭小鼠存活率的影响腹腔注射 D-GalN 与 LPS 混合液（D-GalN：700mg/kg；LPS：35ug/kg），5h 后小鼠开始出现活动减少，精神萎靡，厌食，部分出现抽搐现象；PY 1.5 小鼠一般情况加重，其余各 AMPs 组小鼠的一般情况明显改善。PY、Ts、LL-37、Th 对肝衰竭模型小鼠存活率有一定影响，且存在剂量关系；各组小鼠 48h 存活率为：正常组（100%）、对照组（0）、PY 1.5、3、6（0、60%、40%）、LL-37 1.5、3、6（0、40%、0）、Ts 1.5、3、6（0、20%、40%）、Th 1.5、3、6（0、0、20%）；中等剂量的 PY、LL-37（即 PY3、LL-37 3）小鼠的存活率较高；Ts 、Th 在 1.5-6mg/kg 范围内，随剂量升高，存活率升高。（见图 6-9）。

HE染色,D-氨基半乳糖,急性肝衰竭,肝脏

肝脏大体图、HE染色结果(A:正常组B:对照组C:

激活型,肝组织,D-氨基半乳糖,急性肝衰竭

抗菌肽对 D-氨基半乳糖联合内毒素诱导小鼠急性肝衰竭保护作用的研究第二部分图 11 免疫组化法检测肝组织 Caspase-3（激活型）表达（A：正常组 B：对照组 C：PY 1.5 D：PY 3E：PY 6）

【参考文献】