抑制EZH2甲基转移酶活性预防炎症性肠病和结肠炎相关结直肠癌

发布时间：2020-07-17 17:16

【摘要】：研究背景:炎症性肠病(IBD)以慢性复发性胃肠道炎症为主要特征,包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。IBD是一个全球性的健康问题,在所有人群中的流行率都在急剧上升。患有IBD的患者生活质量较差,患结肠炎相关性结直肠癌(CAC)的风险高出2到8倍。然而,发病机理不清导致相关药物及治疗手段进展缓慢已成为有效治疗IBD的最大阻碍。因此,全面阐明IBD发生、发展的分子机制,为加速有效治疗药物研发提供理论支持是临床亟待解决的问题。肠黏膜失衡的免疫应答是IBD发生发展的核心环节。研究证实,在IBD发病过程中巨噬细胞、树突状细胞等炎症细胞异常激活,相关的细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-17A等也会出现异常。而免疫抑制性细胞,如调节性T细胞(Treg)、髓系来源的抑制性细胞(MDSCs)却存在数量或功能的缺陷。因此,深入研究肠炎状态下免疫细胞的分子调控机制,是恢复肠道免疫稳态,防治IBD的关键。另外IBD中存在异常组蛋白修饰,被认为是IBD发病机制的重要组成部分。组蛋白-赖氨酸N-转甲基酶2(EZH2)是一种重要的组蛋白甲基转移酶,其主要功能是通过催化组蛋白H3第27位的赖氨酸位点发生三甲基化(形成H3K27Me3),进而沉默下游基因表达。EZH2能在多方面调节免疫应答:促进造血干细胞(HSC)自我更新,维持外周Treg、Th1、Th2、Th17、巨噬细胞等的数量及功能。EZH2活性丧失将显著损害T、B细胞发育过程,促进NK细胞前体分化发育,导致骨髓及外周组织中T、B细胞比例降低,NK细胞数量增多。新近报道显示,IBD病人结肠活检标本中EZH2表达异常。干扰组蛋白调节器的功能可能是新治疗策略开发的一个有效途径。鉴于免疫细胞在IBD发病机制中的已知作用以及EZH2参与免疫细胞发育、分化和功能,我们课题着手研究抑制EZH2甲基转移酶活性能否通过改变肠道免疫反应影响IBD进展。方法:1.研究抑制EZH2甲基转移酶活性对IBD的作用。采用DSS构建C57BL/6小鼠IBD模型,尾静脉注射EZH2甲基转移酶抑制剂GSK343,观察其对小鼠病理、肠道、及症状改变、并经ELISA检测相关炎症因子变化。2.研究抑制EZH2甲基转移酶活性对CAC形成的影响。采用AOM联合DSS诱导CAC模型,经尾静脉注射GSK343,观察肿瘤负荷和患病率等指标来评估GSK343对CAC形成的影响。3.探索抑制EZH2甲基转移酶活性对IBD肠道免疫细胞的影响。采用DSS构建C57BL/6小鼠IBD模型,然后经尾静脉注射GSK343后,使用流式细胞术比较GSK343处理组及对照组小鼠,结肠固有层(cLP)中Th17、Treg、巨噬细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞和MDSC比例和数量。结果:1.抑制EZH2甲基转移酶活性能有效缓解炎症性肠病。GSK343预防性治疗可降低DSS诱导的病理和临床症状,包括体重、DAI、结肠长度和组织学评分。同时IL-6和IL-1β水平显著降低,TNF-α和IL-17a水平未受影响。而当IBD形成后再用GSK343治疗仍然可以取得显著的获益。2.抑制EZH2甲基转移酶活性可有效降低CAC的发病率和肿瘤负荷。肿瘤模型到第72天,对照组小鼠100%出现CAC,而GSK343治疗组小鼠只有50%出现CAC,并且肿瘤负荷降低。另一批小鼠观察到第84天,尽管对照组和GSK343治疗组小鼠的CAC发生率相似,但GSK343治疗组小鼠的肿瘤负荷显著降低。3.抑制EZH2甲基转移酶活性通过MDSC富集缓解肠炎。与对照组相比,GSK343治疗组的cLP中,可见Th17、Tregs、巨噬细胞、树突状细胞和嗜酸性粒细胞的比例和绝对数在cLP中均无显著差异。而MDSC比例增高,肠道原位组织检测可见Gr-1阳性细胞增多。使用特异性Gr-1抗体清除MDSCs后,可显著逆转GSK343对结肠炎的保护作用。结论:抑制EZH2甲基转移酶活性(GSK343)可预防和治疗DSS诱导的实验性IBD。同时,由于对结肠炎症的控制,CAC的发生率和肿瘤负荷有所降低。机制研究发现GSK343所致的MDSC在肠道中富集是其保护IBD的关键机制。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R574;R735.3
【图文】：

给药,小鼠,结肠,结肠炎

图 1（a）DSS 诱导小鼠急性结肠炎的方法及 GSK343 给药。（b）小鼠的体重的变化。（c）疾病活动指数。（d）结肠长度的照片和相应统计图。（e）远端结肠切片的代表性苏木精和伊红染色，以及相应组织学评分。2.3.2 抑制 EZH2 甲基转移酶活性可降低 IBD 肠道组织中细胞炎症因子表达较对照组，GSK343 处理可导致包括 IL-6 和 IL-1β 在内的促炎细胞因子水平显著降低，而 TNF-α 和 IL-17a 的水平未受影响，表明 GSK343 治疗降低了 DSS 诱导的结肠炎期间的炎症反应。

细胞因子,远端,结肠,小鼠

图 1（a）DSS 诱导小鼠急性结肠炎的方法及 GSK343 给药。（b）小鼠的体重的变化。（活动指数。（d）结肠长度的照片和相应统计图。（e）远端结肠切片的代表性苏木精和伊红染色相应组织学评分。2.3.2 抑制 EZH2 甲基转移酶活性可降低 IBD 肠道组织中细胞炎症因子表达较对照组，GSK343 处理可导致包括 IL-6 和 IL-1β 在内的促炎细胞因子水平低，而 TNF-α 和 IL-17a 的水平未受影响，表明 GSK343 治疗降低了 DSS 诱导的期间的炎症反应。

实验设计,小鼠,结肠炎

但可显著改善 DAI 评分（图 3c）及结肠炎的其他症状，包括结肠缩短（图3d）和组织评分（图 3e）。以上结果说明抑制 EZH2 甲基转移酶对 DSS 诱导的结肠炎具有治疗作用。图 3（a）GSK343 治疗 DSS 诱导的 C57BL/6 小鼠急性结肠炎的实验设计。（b）小鼠的体重的变化。（c）疾病活动指数。（d）结肠长度的照片和相应统计图。（e）远端结肠切片的代表性苏木精和伊红染色，以及相应组织学评分。2.4 讨论目前，多数研究者认为一般的 IBD 患者不需要太多的药物预防干预，但是大部分IBD 患者在发作间歇期总是会有很大的心理焦虑而影响病情。[25]一款安全有效副作用低的预防药物在这一领域还是相对的空白。组蛋白修饰的可逆性使 EZH2 成为治疗干预的合适靶点。虽然 EZH2 似乎是一个关键的免疫调节因子，但其如何影响炎症和免疫疾病的进展仍然不清楚。在这里，我们首次证明，使用低剂量的甲基转移酶抑制剂（GSK343和 GSK126）干扰 EZH2 活性可改善 DSS 诱导的结肠炎。具体来说，预防性使用抑制EZH2 甲基转移酶活性的药物显著减少了结肠炎相关症状，延长了结肠炎小鼠的生存期，减少了炎症因子分泌和促进了病理状态改善。即使在小鼠已经出现了炎症性结肠炎症状和体征后，EZH2 甲基转移酶抑制剂的治疗依然有良好疗效并且明显改善了预后。EZH2 甲基转移酶抑制剂目前正在各种恶性肿瘤的临床试验中进行研究，我们的发

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