牛磺胆酸对肝细胞和肝星状细胞的影响及其可能机制

发布时间：2020-07-18 23:46

【摘要】：背景与目的:胆汁淤积即胆汁生成或排泌发生障碍,胆汁酸在肝内积聚使肝细胞暴露于持续升高的胆汁酸中,最终导致肝损伤、细胞凋亡以及细胞坏死。肝细胞损伤引发肝邻近细胞(枯否细胞的激活、肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSCs)以及其他炎性细胞)的招募和活化,持久反复的肝星状细胞的激活引起以广泛瘢痕形成以及肝结构和功能紊乱为特征的肝纤维化、肝硬化。一项统计学分析显示,2010年全球由于肝硬化引起死亡的人数已经超过1百万。因此,肝硬化是全球健康医疗系统的一个极大负担,绝大多数的肝硬化只能被控制,并不能被治愈。因此,找到新的危险因素以及可能的治疗靶点对于防治肝硬化以及药物开发具有重要意义。胆汁淤积是终末期肝硬化普遍的病理生理状态,以往研究表明胆汁酸与肝硬化的进展有关。我们团队也发现某些特定胆汁酸的组成在肝硬化患者中发生改变。本课题组前期通过超高相液相色谱质谱连用仪(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)检测了32名肝硬化患者以及27名健康志愿者的12种血清胆汁酸的浓度,结果显示牛磺胆酸(Taurocholic acid,TCA)、甘氨胆酸(Glycocholic acid,GCA)、牛磺脱氧胆酸(Taurochenodeoxycholic acid,TCDCA)发生显著改变,这三种差异胆汁酸在肝硬化患者血清中明显增加,其中TCA升高最显著。此外,肝硬化患者血清TCA水平与肝硬化严重程度评价指标------Child-Pugh正相关。然而这些特定胆汁酸在促进肝硬化的机制并不清楚,因此,本研究通过细胞及分子学研究模拟肝硬化状态下的体内微环境,旨在探究TCA对肝细胞、肝星状细胞的影响及其可能机制。材料与方法:肝星状细胞系LX-2以及肝细胞系HepG2的细胞实验用来探究牛磺胆酸对肝细胞、肝星状细胞的影响及其可能机制。分别对LX-2细胞、HepG2细胞以及Tranwell共培养的两种细胞给予病理浓度的TCA干预,细胞毒性及增殖实验、Western blot实验以及ELISA实验用来检测TCA对肝细胞毒性作用、炎症相关指标血红素氧合酶1(Heme oxygenase 1,HO-1)和Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)的表达、肝星状细胞增殖指标α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、一型胶原(type I collagen,CoI1A1)、转化生长因子-β1(Transformed growth factorβ,TGFβ1)以及TLR4、HO-1水平。结果1.相比对照组,病理浓度下的TCA并没有对HepG2细胞产生毒性作用,而TCA促进LX-2细胞增殖。2.相比对照组,50μM、100μM TCA干预HepG2细胞后,TLR4的表达显著增加,HepG2细胞的HO-1表达水平也被TCA显著诱导。3.LX-2细胞被TCA干预后,CoI1A1、α-SMA、HO-1以及TLR4的表达水平较对照组显著增加。这些结果预示TCA促进肝星状细胞增殖可能通过上调TLR4/HO-1信号通路。4.TCA对LX-2细胞的以上促增殖作用通过与HepG2细胞共培养后增强。共培养组LX-2细胞上清TGFβ1水平较LX-2细胞单独培养组显著增加。结论:TCA可能通过上调TLR4/HO-1信号通路诱导肝细胞以及肝星状细胞炎症反应,并促进肝星状细胞增殖,进而加剧肝硬化的进展。TCA不仅仅是肝硬化进展的活性促进因子,TCA可能成为胆汁淤积性肝病预防和治疗的潜在靶点。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575.2
【图文】：

模式图,共培养,模式图,裂解液

图 1 Tanswell 共培养模式图印迹（Western blot）方法检测 HepG2 细胞以及 LX-2 细胞中目蛋白提取IPA 裂解液，对 HepG2 细胞以及 LX-2 细胞进行裂解，裂解液融化，在使用前数分钟内加入 PMSF（为了避免细胞蛋白降解度为 1mM；板内的培养基，预冷 PBS 洗两遍。每孔加入 RIPA 裂解液 10吹打数下，边吹打边轻轻晃动，使裂解液与细胞充分接触，；充分裂解后，12000g 离心 30min，取上清。部分进行 BCA 蛋0℃冰箱冻存。

HepG2细胞,蛋白表达,细胞的,毒性实验

图 2 （A）CCK8 毒性实验检测 HepG2 细胞的存活率（B）CCK8 增殖实验检测 LX-2 细胞的增殖率（*P<0.05）2. TCA 对肝细胞 TLR4 以及 HO-1 表达的影响基于以上的结果，我们选取 50μM 以及 100μM TCA 作为接下来的实验浓度。我们可以从图 3 看出，相比对照组，HepG2 细胞 TLR4 的表达显著增加(P<0.05)。而且，HepG2 细胞的 HO-1 表达水平也被 TCA 显著诱导(P<0.05)。

细胞,共培养,细胞的,细胞共培养

图 4 TCA 对 LX-2 细胞 CoI1A1、α-SMA、HO-1 以及 TLR4 表达的影响：*P<0.05。4. TCA 加剧了与 HepG2 细胞共培养的 LX-2 细胞的增殖通过以上实验，我们得出 TCA 能上调 HepG2 细胞促炎性基因 TLR4 以及 HO-表达。而且，TCA 能促进 LX-2 细胞的增殖。因此，我们对这两种细胞进行共培养探讨两种细胞的交互作用。如图 5 所示，我们的结果显示当 LX-2 细胞与 HepG细胞共培养后，TCA 促进 LX-2 细胞的增殖效应更为显著。相比 LX-2 细胞单独用50μM TCA 处理组,50μM TCA 共培养组 LX-2 细胞的 CoI1A1 蛋白表达显著增加，具有统计学意义（P<0.05）。同时，100μM TCA 单独培养组与 100μM TCA 共培养组的 LX-2 细胞相比，后者的 CoI1A1 蛋白上调明显（P<0.05）。我们又检测了LX-2 细胞单独培养组与共培养组 LX-2 细胞的 HO-1、TLR4 的蛋白表达水平，我们的数据显示共培养组的 LX-2 细胞的 HO-1 以及 TLR4 的表达水平被明显诱导，差异具有统计学意义（P<0.05）。

【参考文献】