SK通道在雌二醇抑制大鼠结肠平滑肌收缩中的作用及机制

发布时间：2020-07-18 23:56

【摘要】：[背景]便秘是全球性的常见病和慢性病,已成为影响人们身心健康和生活质量的重要因素之一。越来越多的研究发现,便秘的症状和发病均存在明显的性别相关性,女性的症状更严重、发病率更高,提示雌激素可能在便秘的发生发展中有重要作用。此外,动物实验发现雌激素可使大鼠结肠扩张,离体肌条实验也证实雌激素可抑制人结肠平滑肌收缩,其机制尚未完全明确。离子通道是影响胃肠运动的关键因素之一,目前小电导钙激活钾离子通道(small conductance Ca2+ activated K+ channels, SK)的作用倍受关注,它是一种Ca2+高敏感性、非电压依赖性的选择性K+通道,可参与抑制结肠平滑肌收缩作用。在中枢神经元、子宫平滑肌细胞等研究中发现,雌激素不仅直接影响SK通道的功能,还影响其表达。但SK通道是否介导了雌激素(17p-雌二醇)对结肠平滑肌的舒张作用仍不清楚。[目的]1.探讨SK通道在17p-雌二醇(17p-estradiol, E2)抑制大鼠结肠平滑肌收缩中的作用。2.探讨E2对大鼠结肠平滑肌细胞(smooth muscle cells, SMCs)上SK3表达的影响及机制。[方法]1.取雄性成年SD大鼠结肠制备肌条(1)E2和SK通道阻断剂对卡巴胆碱(carbachol, CCh)诱导的结肠收缩的影响：CCh刺激结肠平滑肌肌条产生瞬时收缩后,分别给予溶剂DMSO、E2和SK通道阻断剂蜂毒明肽,观察各自对肌条收缩的影响。(2)SK通道阻后,E2对结肠收缩的影响：CCh刺激肌条产生瞬时收缩后,立即予蜂毒明肽预处理10 min,再加E2刺激,观察肌条收缩情况。2.酶解法分离培养雄性成年SD大鼠结肠SMCs(1)检测SK通道在大鼠结肠SMCs中的表达：①免疫荧光双标法观察SK2.SK3与a-Actin共表达情况；② qRT-PCR检测SK2、SK3的基因表达情况。(2)E2对大鼠结肠SMCs上SK3表达的影响：以不同浓度和不同时间E2刺激SMCs后,以qRT-PCR、Western blot分别检测SMCs上SK3的mRNA和蛋白水平。(3)雌激素核受体在E2调节SK3表达中的作用：分别给予E2、雌激素受体拈抗剂(ICI 182780)以及BSA结合的E2)BSA-E2,非细胞膜通透性)刺激SMCs,用Western blot检测SK3的蛋白水平。(4)雌激素Ⅸ受体在E2调节SK3表达中的作用：分别给予E2、α受体激动剂(PPT)及p受体激动剂(DPN)刺激SMCs,用Western blot检测SK3的蛋白水平。[结果]1.与溶剂DMSO组比,E2刺激后肌条张力迅速降低(P=0.019)；而给予SK通道阻断剂蜂毒明肽后,肌条张力迅速增加(P=0.047)2.蜂毒明肽预处理后再加E2刺激,肌条的收缩张力较DMSO组明显降低(P=0.014),但仍显著高于E2组(P=0.026)3.细胞免疫荧光双标显示大鼠结肠SMCs上SK2、SK3均与a-Actin共表达,且在SMCs内,SK3 mRNA表达水平高于SK2 mRNA水平(P=0.021)。4.E2可促进体外培养的SMCs上SK3 mRNA和蛋白表达,50 nmol/L是最大有效浓度(P0.05);在E2作用下,SK3表达的高峰时间为第12 h和24 h(P0.05)。5.予ICI 182780预处理后加入E2,SK3蛋白表达显著低于E2组(P0.05),而BSA-E2对SK3的表达无影响。6.α受体激动剂PPT可显著促进SK3表达(P0.05),作用基本与E2一致；p受体激动剂DPN对SK3无影响。[结论]1.E2抑制大鼠结肠环肌收缩的作用,部分通过激活蜂毒明肽敏感的SK通道完成。2.大鼠结肠SMCs上存在SK2、SK3,且SK3的mRNA水平高于SK2。3.体外E2刺激能上调大鼠结肠SMCs内SK3表达,该作用通过ERα完成。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R574.62
【图文】：

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南京医科大学硕士学位论文结果一、E2 及蜂毒明肽对 CCh 诱导的大鼠结肠环肌收缩的影响10-4mol/L CCh 致大鼠结肠环肌收缩达最大值后，与空白对照组相比，0.1%DMSO 刺激，肌条张力无明显变化（数据未给出）。由于各肌条间收缩变化差异大，结果均以占 CCh 诱导最大收缩值的百分比表示。发现与溶剂 DMSO 组比，1 μmol/L E2 刺激使肌条收缩张力迅速降低（50.68% ± 24.78% vs 7.29% ± 4.65%，P=0.019）；而给予 1 μmol/L SK 通道阻断剂蜂毒明肽后，肌条收缩张力迅速增加（50.68% ± 24.78% vs 84.67% ± 14.28%，P=0.047）（见图 1）。证实 E2、激活的 SK 通道均可抑制大鼠结肠环肌收缩。

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南京医科大学硕士学位论文二、蜂毒明肽在 E2 抑制大鼠结肠环肌收缩中的作用为明确 SK 通道是否参与 E2 抑制大鼠结肠环肌收缩的过程，在 CCh 致肌条收缩达最大值后，先予 SK 通道阻断剂蜂毒明肽预处理 10 min，再加 E2 刺激，肌条的收缩张力较溶剂 DMSO 组降低（30.95% ± 4.09% vs 58.64% ± 16.19%，P=0.014），但仍显著高于 E2 组（30.95% ±4.09% vs 6.97% ± 4.37%，P=0.026）（见图 2）。提示 E2 抑制大鼠结肠环肌收缩的作用部分是通过蜂毒明肽敏感的SK 通道完成的。

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南京医科大学硕士学位论文结果一、SK 通道在大鼠结肠 SMCs 的表达文献报道，SK 家族的 3 个亚型在胃肠道分布不一，SK1 表达极弱，SK2 和SK3 则分布较广[4, 5]。因此对培养的结肠 SMCs 进行 SK2、SK3 与 α-Actin 的免疫荧光双标，显示：α-Actin 荧光反应阳性（大部分细胞浆内见红色荧光），SK2、SK3 也分别呈阳性反应（绿色荧光），细胞核 Hoechst 染色呈蓝色，即 SK2、SK3分别与 α-Actin 存在共表达（图 1A，B）。提示培养的细胞为 SMCs，且该大鼠结肠 SMCs 表达 SK2、SK3。将 SMCs 提取 RNA，分别对 SK2 和 SK3 进行 qRT-PCR，发现 SK3 mRNA水平明显高于 SK2 mRNA 水平（0.951 ± 0.103 vs 0.690 ± 0.331；P=0.021）（图1C）。

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