肿瘤坏死因子-α刺激骨髓间充质干细胞增强对肝星状细胞凋亡的影响
发布时间：2020-07-19 10:26
【摘要】：目的:观察肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激骨髓间充质干细胞(BMSCs)情况下,共培养体系中BMSCs对肝星状细胞(HSCs)凋亡的影响,探讨TNF-α刺激的BMSCs诱导HSCs凋亡的机制。 方法:贴壁筛选法培养、纯化SD大鼠BMSCs,传代至第3-6代使用,大鼠HSCs细胞系及纤维原细胞系冻融后传代使用。在半透膜(transwell insert)上接种HSCs,在6孔塑料培养板上接种BMSCs,建立上下共培养体系。实验分6组:①HSCs空白对照组:单独HSCs培养;②HSCs阴性对照组:纤维原细胞+HSCs共培养;③BMSCs空白对照组:单独BMSCs培养;④BMSCs刺激培养组:BMSCs+TNF-α培养;⑤正常共培养组:BMSCs+HSCs共培养;⑥刺激共培养组:BMSCs+TNF-α+HSCs共培养。培养观察24h、48h,各时间段在倒置相差显微镜下观察HSCs细胞形态学改变;免疫组化法检测HSCsα-SMA表达;MTT检测HGF对HSCs增殖抑制率;流式细胞仪Annexin-V-FITC/PI双染法检测HSCs凋亡率;RT-PCR、Western blot分别检测HSCs RhoA mRNA和蛋白以及BMSCs HGF mRNA和蛋白表达;收集培养体系上清液,ELISA测定上清液中HGF的表达。 结果:1.HGF单独刺激HSCs无明显增殖抑制作用,与HSCs空白对照组比较无统计学意义。2.两组共培养组HSCs凋亡率呈现时间依赖性增加,刺激共培养组(24,48 h: 6.583±0.091%,29.960±0.223%)与正常共培养组(24,48 h: 4.700±0.168%,23.140±0.115%)比较差异有统计学意义(P 0.01)。3.两组共培养组HSCs RhoA蛋白及mRNA的表达呈时间依赖性下降,与HSCs空白对照组和阴性对照组比较差异有统计学意义(P0.01);刺激共培养组与正常共培养组比较差异有统计学意义(P 0.01);两组共培养组BMSCs HGF蛋白及mRNA的表达呈时间依赖性增加,与BMSCs空白对照组比较差异有统计学意义(P 0.01),刺激共培养组与正常共培养组比较差异有统计学意义(P 0.05);BMSCs刺激培养组HGF蛋白及mRNA的表达呈时间依赖性增加,与BMSCs空白对照组比较差异有统计学意义(P 0.01)。4.ELISA测定上清液结果显示:HSCs自分泌HGF,24h时段分泌量(34.573±0.071 ng/ml)高于48h时段(21.733±0.133 ng/ml);BMSCs自分泌HGF,48h时段分泌量高于24h时段,BMSCs刺激培养组HGF分泌量[24,48 h:(18.791±0.080),(25.123±0.074) ng/ml) ]高于BMSCs空白对照组[24,48 h:(14.16±0.11),(18.19±0.12)ng/ml](P 0.01);刺激共培养组[24,48 h:(13.917±0.070), (11.420±0.036) ng/ml]在相应时段HGF的分泌量高于正常共培养组[24,48 h:( 11.897±0.045),( 11.297±0.031) ng/ml],两组比较差异有统计学意义(P 0.01)。 结论: HSCs与BMSCs共培养上调BMSCs HGF的表达,抑制HSCs RhoA表达,促进HSCs的凋亡,TNF-α刺激BMSCs后共培养增强了这些作用;通过旁分泌HGF及其它因子的协同作用途径,可能是BMSCs促进HSCs凋亡和抑制RhoA表达的机制。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575.2
【图文】：
图 1-5 第 3 代骨髓间充质干细胞表面标记的流式结果Fig 1-5 Flow cytometry results of P3 BMSCs surface markers形态及 a-SMA 的表达 (图 2-1～图 2-4）细胞 12 培养小时，在培养瓶中完全帖壁生长，呈圆形或细胞变长且分裂增殖，呈纤维样细胞形状，细胞核分裂相后的星状细胞生长速度加快，48 小时成典型的成纤维细胞化学染色显示,培养 48 小时 HSC 的 a-SMA 表达呈阳性，并成棕色细条索状。HSC 呈星形，胞体大，呈片状伸展，伪性表达率 95%以上。
图 2-3 HSCs a-SMA 免疫组化(50×) 图 2-4 HSCs a-SMA 免疫组化(100×)Fig 2-3 immunohistochemisty of a-SMA Fig 2-4 immunohistochemisty of a-SMAin HSCs (50×) in HSCs (100×)3. 纤维原细胞相差显微镜下观察（图 3-1, 图 3-2）纤维原细胞12小时后在培养瓶中完全帖壁生长各组成纤维细胞形态基本相似，呈梭形或不规则三角形，放射状或旋涡状走行。图 3-1 纤维原细胞 (50×) 图 3-2 纤维原细胞(100×)Fig 3-1 fibroblast cells (50×) Fig 3-2 fibroblast cells(100×)
图 2-3 HSCs a-SMA 免疫组化(50×) 图 2-4 HSCs a-SMA 免疫组化(100×)Fig 2-3 immunohistochemisty of a-SMA Fig 2-4 immunohistochemisty of a-SMAin HSCs (50×) in HSCs (100×)3. 纤维原细胞相差显微镜下观察（图 3-1, 图 3-2）纤维原细胞12小时后在培养瓶中完全帖壁生长各组成纤维细胞形态基本相似，呈梭形或不规则三角形，放射状或旋涡状走行。图 3-1 纤维原细胞 (50×) 图 3-2 纤维原细胞(100×)Fig 3-1 fibroblast cells (50×) Fig 3-2 fibroblast cells(100×)
本文编号：2762293
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575.2
【图文】：
图 1-5 第 3 代骨髓间充质干细胞表面标记的流式结果Fig 1-5 Flow cytometry results of P3 BMSCs surface markers形态及 a-SMA 的表达 (图 2-1～图 2-4）细胞 12 培养小时，在培养瓶中完全帖壁生长，呈圆形或细胞变长且分裂增殖，呈纤维样细胞形状，细胞核分裂相后的星状细胞生长速度加快，48 小时成典型的成纤维细胞化学染色显示,培养 48 小时 HSC 的 a-SMA 表达呈阳性，并成棕色细条索状。HSC 呈星形，胞体大，呈片状伸展，伪性表达率 95%以上。
图 2-3 HSCs a-SMA 免疫组化(50×) 图 2-4 HSCs a-SMA 免疫组化(100×)Fig 2-3 immunohistochemisty of a-SMA Fig 2-4 immunohistochemisty of a-SMAin HSCs (50×) in HSCs (100×)3. 纤维原细胞相差显微镜下观察（图 3-1, 图 3-2）纤维原细胞12小时后在培养瓶中完全帖壁生长各组成纤维细胞形态基本相似，呈梭形或不规则三角形，放射状或旋涡状走行。图 3-1 纤维原细胞 (50×) 图 3-2 纤维原细胞(100×)Fig 3-1 fibroblast cells (50×) Fig 3-2 fibroblast cells(100×)
图 2-3 HSCs a-SMA 免疫组化(50×) 图 2-4 HSCs a-SMA 免疫组化(100×)Fig 2-3 immunohistochemisty of a-SMA Fig 2-4 immunohistochemisty of a-SMAin HSCs (50×) in HSCs (100×)3. 纤维原细胞相差显微镜下观察（图 3-1, 图 3-2）纤维原细胞12小时后在培养瓶中完全帖壁生长各组成纤维细胞形态基本相似，呈梭形或不规则三角形，放射状或旋涡状走行。图 3-1 纤维原细胞 (50×) 图 3-2 纤维原细胞(100×)Fig 3-1 fibroblast cells (50×) Fig 3-2 fibroblast cells(100×)
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 胡昆鹏;林楠;林继宗;邓美海;汤照峰;项鹏;许瑞云;;人骨髓间质干细胞对肝星状细胞的体外调控[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年27期
2 苏思标;姜海行;王东旭;覃山羽;梁梓宇;;骨髓间充质干细胞调控肝星状细胞RhoA、P27的表达[J];世界华人消化杂志;2009年32期
3 陈国忠;姜海行;陆正峰;肖健;梁梓宇;覃山羽;;骨髓间充质干细胞共培养对肝星状细胞增殖、凋亡和RohA表达的调控[J];世界华人消化杂志;2010年16期
本文编号：2762293
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/xiaohjib/2762293.html
最近更新
教材专著
