ATGL肝脏组织特异性敲除小鼠的产生及其引起的渐进性脂肪肝机理研究
发布时间：2020-07-19 10:37
【摘要】：肝细胞胞质中甘油三酯(TG)的过多积累形成脂肪肝。脂肪肝是多种肝病包括肝硬化和肝癌的主要原因。目前,关于TG在肝细胞胞质中积累的代谢途径尤其是肝细胞的脂解尚不清楚,但有证据表明脂肪组织甘油三酯水解酶(ATGL)在脂解中发挥十分重要的作用。ATGL全身性敲除鼠肝脏积累脂肪,但由于此小鼠心脏积累过多脂肪而早期致死,因而无法进行肝脏脂解的研究。本论文首次创造了肝脏组织特异性ATGL敲除小鼠(ATGLLKO),通过系统的研究得出以下几点结果: 1.肝脏特异性ATGL缺失引起明显的脂肪肝,且脂肪肝的程度随年龄的增长而加重。组织形态学研究发现ATGLLKO小鼠肝脏脂滴呈明显的规律性分布:大脂滴分布于肝脏门静脉周边而小脂滴则主要集中于中心静脉周边。 2. ATGLLKO小鼠体重正常,并不肥胖,且DEXA扫描发现该小鼠的肌肉量显著高于对照组。血液指标检测显示,ATGLLKO小鼠的葡萄糖,TG和胆固醇水平和对照鼠相似。 3.除肝细胞外,ATGL缺失同时引起胆管上皮细胞脂质的大量积累,但血液GGT及ALP的水平正常。 4. ATGLLKO小鼠肝脏炎症细胞的分布和数量以及TNFα和IL-6的mRNA含量与对照组相似或低于对照。TUNEL染色显示,ATGLLKO小鼠与对照组肝脏凋亡细胞的数量相似。12月龄ATGLLKO肝脏Masson trichrome staining结果呈阴性。ATGLLKO小鼠肝脏内质网VLDL分泌正常。肝脏脂肪酸氧化试验显示β氧化水平和对照相比下降30%。 5.生理水平检测表明,ATGLLKO小鼠具有正常的葡萄糖和胰岛素耐受量以及以丙酮酸为底物的糖异生功能。肝脏水平上胰岛素刺激的Akt磷酸化水平正常。这些结果表明ATGLLKO小鼠具有正常的胰岛素敏感性。 6.尽管ATGLLKO小鼠的脂肪酸氧化下降30%,但48h饥饿条件下ATGLLKO小鼠与野生型鼠的呼吸交换率相似,同时ATGLLKO小鼠血液3-HB与对照组的升高水平相似,表明LKO小鼠完全可以满足应激状态下的能量需求。 7. ATGLLKO小鼠肝脏调控TG合成的重要酶DGAT2的mRNA水平下降了50倍;同时肝脏切片中溶酶体脂质体(lipolysosome)的数量增加了2.7倍,表明TG合成的降低以及溶酶体介导的TG的降解是缓解脂解缺陷的潜在补偿机制。 综上所述,肝脏ATGL缺失引起不伴随肥胖及代谢综合症的原发性脂肪肝。尽管ATGLLKO小鼠的脂肪肝高达20%,但肝脏依然维持正常的功能。ATGLLKO小鼠胆管内脂肪的累积并未影响其功能,表明ATGL也是胆管细胞重要的TG水解酶且无毒害作用。通过对溶酶体自噬作用的研究发现,溶酶体介导的肝细胞胞质中TG的降解是缓解脂肪肝的有效途径。与肥胖和糖尿病引起的脂肪肝相比,ATGL敲除引起的脂肪肝在代谢上具有缓解多种代谢综合症的保护作用,从而推测单纯性脂肪肝对机体起保护作用,而肥胖引起的继发性脂肪肝症状是机体在引发代谢综合症的前提下所产生的次级效应,因而ATGLLKO小鼠是研究脂肪肝以及其形成机理的理想模型。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575.5
【图文】：
及纤维化的分子机理目前并不清楚。氧化应激，线粒因素是近年来报道的可能原因。量摄入是引起脂肪肝的主要原因之一。然而，最近的谢综合症及其并发症之前。肝脏储存脂肪本身是为了用。那么如何研究没有伴随肥胖的原发性脂肪肝对机问题之一。肪酸的简单代谢总结为图 1-1。首先从分析引起脂肪肥胖的主要因素，包括高脂饮食介导的高能量摄入及除了由于某些先天性遗传代谢疾病导致线粒体氧化代质中贮存的 TG 是线粒体 beta 氧化及内质网中 TG 重液中 TG 的水平，那么阻断肝细胞胞质中 TG 的分解代性中间产物的累积，如长链脂肪酸等，进而避免血液从而起到保护肝脏，并且避免全身性代谢综合症的发脂解研究很少。近年来新发现的甘油三酯水解酶(ad为在肝细胞 TG 分解中起重要作用。
图 2-1 小鼠肝脏 ATGL 特异性敲除载体的构建Figure 2-1 Vector construction of specific ATGL knockout因组中 Pnpla2 位点示意图，外显子用填充的长方形表示；向载体（含有 Neo 及 TK 位点，分别为正负筛选的靶基因，两个同方向的；基因。 靶基因底下的短臂片段用作基因组 Southern blotting 的探针（TK,nase, 胸苷激酶）。成功重组的靶基因为含有 Neo 但没有 TK 的基因。步骤简述如下：增小鼠 ATGL 基因外显子 1 和 5’端 336 核苷酸序列的非翻译区以及内含子苷酸序列，将此扩增子连接到 pMC1neoPolyA 工程载体（Stratagen, La Jolla,抗性基因(Neo)下游 BamHI 限制位点；含有 LoxP 位点的寡核苷酸序列克隆插入到以上序列的 5’和 3’端；扩增小鼠 Pnpla2 基因 5’端非翻译区的一段 1035 bp 序列，将其克隆到 loxP游，作为构建载体的短臂；具有磷酸甘油激酶(phosphoglycerate kinase，PGK)启动子的胸腺核苷激酶
H 10.5) 终止反应之后在涡流器上剧烈涡流混射性标记脂肪酸的上层液体用于闪烁计数。 mean ± SEM 方式表达。处理和对照之间的差 细胞转染和胚胎显微注射后，我们从 60 个基因的阳性克隆。将两个胚胎移植后得到 色的雄性小鼠和 C57BL/6 雌性小鼠杂交，得，结果显示存在 ATGLlox/+小鼠及 ATGL +/+
本文编号：2762305
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575.5
【图文】：
及纤维化的分子机理目前并不清楚。氧化应激，线粒因素是近年来报道的可能原因。量摄入是引起脂肪肝的主要原因之一。然而，最近的谢综合症及其并发症之前。肝脏储存脂肪本身是为了用。那么如何研究没有伴随肥胖的原发性脂肪肝对机问题之一。肪酸的简单代谢总结为图 1-1。首先从分析引起脂肪肥胖的主要因素，包括高脂饮食介导的高能量摄入及除了由于某些先天性遗传代谢疾病导致线粒体氧化代质中贮存的 TG 是线粒体 beta 氧化及内质网中 TG 重液中 TG 的水平，那么阻断肝细胞胞质中 TG 的分解代性中间产物的累积，如长链脂肪酸等，进而避免血液从而起到保护肝脏，并且避免全身性代谢综合症的发脂解研究很少。近年来新发现的甘油三酯水解酶(ad为在肝细胞 TG 分解中起重要作用。
图 2-1 小鼠肝脏 ATGL 特异性敲除载体的构建Figure 2-1 Vector construction of specific ATGL knockout因组中 Pnpla2 位点示意图，外显子用填充的长方形表示；向载体（含有 Neo 及 TK 位点，分别为正负筛选的靶基因，两个同方向的；基因。 靶基因底下的短臂片段用作基因组 Southern blotting 的探针（TK,nase, 胸苷激酶）。成功重组的靶基因为含有 Neo 但没有 TK 的基因。步骤简述如下：增小鼠 ATGL 基因外显子 1 和 5’端 336 核苷酸序列的非翻译区以及内含子苷酸序列，将此扩增子连接到 pMC1neoPolyA 工程载体（Stratagen, La Jolla,抗性基因(Neo)下游 BamHI 限制位点；含有 LoxP 位点的寡核苷酸序列克隆插入到以上序列的 5’和 3’端；扩增小鼠 Pnpla2 基因 5’端非翻译区的一段 1035 bp 序列，将其克隆到 loxP游，作为构建载体的短臂；具有磷酸甘油激酶(phosphoglycerate kinase，PGK)启动子的胸腺核苷激酶
H 10.5) 终止反应之后在涡流器上剧烈涡流混射性标记脂肪酸的上层液体用于闪烁计数。 mean ± SEM 方式表达。处理和对照之间的差 细胞转染和胚胎显微注射后，我们从 60 个基因的阳性克隆。将两个胚胎移植后得到 色的雄性小鼠和 C57BL/6 雌性小鼠杂交，得，结果显示存在 ATGLlox/+小鼠及 ATGL +/+
【引证文献】
相关博士学位论文 前1条
1 郭吟;运动—饮食干预与局部按揉对脂代谢和减肥效果的研究[D];上海体育学院;2014年
相关硕士学位论文 前1条
1 张文涛;沙苑子、泽泻降脂作用的比较研究[D];北京中医药大学;2012年
本文编号：2762305
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/xiaohjib/2762305.html
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