COX-2敲除对肝星状细胞增殖的影响

发布时间：2020-07-19 10:47

【摘要】：目的:研究COX-2敲除对肝星状细胞增殖的影响,为临床上逆转肝纤维化提供新的依据以及策略。方法:1.体外培养的大鼠HSC-T6细胞,经过细胞培养传代后,按照病毒最适用量MOI=10,将LV-COX-2-sgRNA慢病毒载体转染至HSC-T6细胞,获得HSC-T6-COX-2~(-/-)细胞,LV-NC-sgRNA转染至HSC-T6细胞获得HSC-T6-NC细胞,并将细胞分为3组:KO组(HSC-T6-COX-2~(-/-)细胞)、NC组(HSC-T6-NC细胞)、CON组(HSC-T6细胞)。2.病毒转染72小时后,于荧光显微镜下观察,再计算转染效率;病毒转染成功后,分别于72h及96h提取3组中的COX-2蛋白,应用Western Blot方法在基因和蛋白水平上进行敲除验证;克隆形成、CCK8方法检测细胞增殖。结果:1.LV-COX-2-sgRNA慢病毒载体转染HSC-T6细胞72 h后,于荧光显微镜下观察,CON组未见绿色荧光出现,KO、NC组细胞可见绿色荧光,转染效率在80%以上,证明病毒转染成功。2.Western Blot检测结果表明:慢病毒转染HSC-T6细胞72h及96h后,KO组COX-2蛋白表达量较CON组和NC组均显著下调,提示COX-2基因敲除成功,差异有统计学意义(p0.01)。3.克隆形成、CCK8检测结果表明:KO组较NC组、CON组HSC-T6细胞的增殖出现明显抑制作用,提示COX-2基因敲除可抑制HSC-T6细胞的增殖,差异有统计学意义(p0.01)。结论:敲除HSC-T6细胞的COX-2基因,能够抑制HSC-T6细胞的增殖。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575
【图文】：

第 3 章 实验结果gRNA 转染效果X-2-sgRNA 质粒为荧光标记，慢病毒转染入 HSC-T6 细胞，感染后 72 h 左光显微镜下观察，细胞会出现绿色荧光。随机选择 10 个视野，计算阳性细胞之比作为质粒转染效率指标，荧光率即为阳性感染率。从图 3.1、图 3.2染 72 小时后，CON 组未见绿色荧光出现，KO、NC 组细胞均可见绿色荧效率达 80%以上，且细胞状态正常，说明病毒转染成功。Bright GFP

13图 3.2 左右分别是同一视野下光学显微镜图和荧光显微镜图（×200 倍） 组（HSC-T6 细胞组）；NC 组（LV-NC-sgRNA 病毒转染组）；KO 组（LV-COX-2-sgRNA组）；荧光表达效率达到 80%以上。X-2 敲除效果-T6 细胞被慢病毒转染 72h、96h 后，分别收集 CON、NC、KO 三组

的 COX-2 蛋白，利用 WB 检测 COX-2 蛋白质表达量，内参选择 GAPDH。结果示：72h 后 KO 组细胞的灰度值为 0.068±0.00001，较 CON 组的灰度值 0.456±106 以及 NC 组的灰度值 0.449±0.084 均显著下调，组间灰度值呈显著性差异，具统计学意义（p＜0.01）。96h 后 KO 组细胞的灰度值为 0.065±0.020，较 CON 组灰度值 1.220±0.097 以及 NC 组的灰度值 0.397±0.122 均显著下调，组间灰度值显著性差异，具有有统计学意义（p＜0.01）。（图 3.3，3.4）。

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本文编号：2762316