IL-17在骨髓干细胞促进肝损伤修复中的作用研究

发布时间：2020-07-20 13:31

【摘要】：【背景】肝硬化是由各种慢性肝脏损害所导致的肝脏疾病晚期阶段。对于失代偿期肝硬化，内科常规的保肝和对症治疗不能延长患者生存期，原位肝移植是唯一有效的治疗手段，但受供肝缺乏、费用高昂等因素的严重限制。近年来，随着干细胞相关研究的不断深入，自体骨髓源干细胞（Bone marrow-derived stem cells, BMSCs）用于人类多种疾病的治疗取得了重要进展。越来越多的临床探索性研究发现，自体BMSCs移植能有效地提升失代偿期肝硬化患者的肝功能。有关干细胞促进肝功能恢复的机理，大多数学者认为，除了转分化为肝细胞或与内源肝细胞融合外，干细胞主要通过调控机体免疫状态或肝脏免疫微环境而发挥作用。然而，自体BMSCs移植使机体免疫状态发生了什么样的变化仍未见报道。本课题组前期进行了自体干细胞移植治疗失代偿期肝硬化的临床探索性研究。我们利用粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF）将BMSCs动员到外周血中，再从外周血中分离出干细胞，最后将获得的干细胞通过血管介入回输至患者肝动脉。针对失代偿期肝硬化患者的临床随机对照研究表明，与仅接受G-SCF处理的患者相比，接受自体干细胞移植的患者肝功能显著提高。至2012年12月，我们对416例失代偿期肝硬化患者进行了自体干细胞移植治疗，随访结果表明，干细胞治疗显著提高了患者的3年生存率（87%，对照组为29%）。我们对42例接受干细胞移植治疗的患者进行了免疫相关指标的检测，结果发现：在干细胞治疗后第1、3、6、9、12月，患者外周血IL-17水平呈持续下降趋势，并与患者肝功能指标的变化呈正相关。提示IL-17可能与BMSCs促进肝功能恢复有关。本研究将采用四氯化碳（Carbon tetrachloride, CCl_4）制备小鼠肝损伤模型，并对肝损伤小鼠进行同源BMSCs移植治疗。利用这一模型，探讨IL-17在CCl_4诱导小鼠肝损伤和BMSCs改善肝损伤过程中的作用，为阐明BMSCs促进肝病患者肝功能恢复的机理提供理论依据。【目的】 1.明确IL-17在CCl_4诱导小鼠肝损伤中的作用； 2.阐明IL-17在BMSCs促进小鼠肝损伤修复中的作用。【方法】 1.采用CCl_4腹腔注射诱导小鼠肝损伤。在肝损伤诱导过程中，HE和天狼星红染色检测小鼠肝脏炎症和纤维化程度，血浆生化检测丙氨酸转移酶（alanineaminotransferase, ALT）、白蛋白（albumin, ALB），同时采用ELISA检测小鼠外周血IL-17水平，Real-time PCR检测小鼠肝组织表达促炎因子IL-6、IL-8、TNF-、IFN-γ、IL-17A、IL-17F以及IL-17RA和IL-17RC的水平，流式细胞术检测肝内单核细胞中Th17细胞的百分比； 2.给予特异性抗小鼠IL-17抗体（Anti-IL-17mAb）或重组小鼠（Rm）IL-17干预CCl_4诱导小鼠肝损伤过程，HE和天狼星红染色检测小鼠肝脏炎症和纤维化程度，血浆生化检测ALT、ALB，Real-time PCR检测肝纤维化相关因子基质金属蛋白酶3（Matrix metalloproteinase3, MMP3）、金属蛋白酶组织抑制剂1（Tissueinhibitor of metalloproteinase1, TIMP1）和TGF-β1的表达，免疫组化、Real-time PCR和Western blot检测肝组织表达-SMA的情况； 3.将同品系小鼠BMSCs经尾静脉移植给CCl_4诱导的肝损伤小鼠（5×106BMSCs/只），采用ELISA检测小鼠外周血IL-17水平，Real-time PCR检测小鼠肝组织IL-17A、IL-17F、IL-17RA、IL-17RC及IL-23p19的表达水平，流式细胞术检测肝内单核细胞中Th17细胞的百分比； 4.给予Anti-IL-17mAb和RmIL-17因子干预BMSCs治疗CCl_4诱导小鼠肝损伤的过程，HE和天狼星红染色检测肝组织炎症和纤维化程度，Real-time PCR检测肝内胶原层蛋白collagen-1的表达，血清生化检测小鼠肝功能（ALT和ALB水平）。【结果】 1. IL-17与小鼠肝损伤过程密切相关 HE、天狼星红染色和血清生化检测结果显示，连续6周CCl_4腹腔注射成功诱导出小鼠肝损伤模型，表现为肝组织内大量炎性细胞浸润、纤维化形成，外周血ALT升高而ALB水平显著降低。ELISA、Real-time PCR和流式细胞术检测发现，在CCl_4诱导肝损伤过程中，外周血IL-17水平和肝组织内IL-17A、IL-17F、IL-17RA、IL-17RC、IL-6、IL-8、TNF-的表达水平逐渐升高，而肝组织内Th17细胞百分比和IFN-γ的表达水平无明显变化。当撤除CCl_4后，小鼠肝损伤逐渐恢复，外周血IL-17水平和肝组织内IL-17A、IL-17F、IL-17RA、IL-17RC、IL-6、IL-8、TNF-的表达水平也逐渐恢复至几乎正常。 2. IL-17促进CCl_4诱导小鼠肝损伤在用CCl_4制备小鼠肝损伤过程中，和仅给予CCl_4腹腔注射组相比，联合注射RmIL-17能显著加重小鼠肝损伤，而联合注射Anti-IL-17mAb却显著减轻CCl_4诱导的肝损伤。Real-time PCR、免疫组化和Western blot结果显示，与单纯使用CCl_4相比，联合使用CCl_4和RmIL-17显著增加了肝组织内MMP3、TIMP1、TGF-β1、-SMA的表达，而联合使用CCl_4和Anti-IL-17mAb却抑制了MMP3、TIMP1、TGF-β1、-SMA的表达。 3.同源BMSCs下调小鼠IL-17表达水平同源BMSCs移植治疗能有效改善CCl_4诱导的小鼠肝损伤。在BMSCs促进肝损伤恢复的同时，小鼠外周血IL-17水平也明显下降，逐渐恢复至几乎正常水平；肝组织内IL-23p19、IL-17A、IL-17F、IL-17RA和IL-17RC的表达也显著下降；但是肝内Th17细胞百分比无明显变化。 4. IL-17在BMSCs促进CCl_4诱导的小鼠肝损伤修复过程中起重要作用在BMSCs移植治疗CCl_4诱导的小鼠肝损伤过程中，加入外源性RmIL-17显著减弱了BMSCs的治疗效果。与BMSCs治疗组相比，BMSCs联合RmIL-17组小鼠的肝组织炎症和纤维化显著加重。采用Anti-IL-17mAb对肝损伤小鼠治疗，结果发现其能显著减轻肝组织炎症和纤维化程度，且与BMSCs移植治疗组无明显差异。【结论】本研究表明，IL-17参与了CCl_4诱导小鼠肝损伤的病理过程，BMSCs可能通过下调IL-17发挥促进小鼠肝损伤恢复的作用。BMSCs下调IL-17和IL-17促进肝损伤的机制值得下一步深入研究。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575.2
【图文】：

干细胞,肝损伤,亚群,骨髓

图 1. 骨髓源干细胞亚群及其在肝损伤中的可能作用[25]那么，混合的 BMSCs 治疗效果是否优于单一类型的干细胞？目前尚不清楚。大量的临床研究采用混合 BMSCs 治疗肝脏疾病，研究表明移植的 BMSCs 能有效改善患者肝功能[90-92]。在临床研究中，我们采用 G-CSF 将失代偿期肝硬化患者的 BMSCs 动员至外周血，再分离、采集骨髓干细胞，之后应用血管介入方法将采集的干细胞经肝动脉回输至患者肝脏，并对患者进行随访。至 2012 年 12 月，我们对 416 例失代偿期肝硬化患者进行了自体干细胞移植治疗，随访结果表明，干细胞治疗显著提高了患者的3 年生存率（87%，对照组为 29%）。目前关于 BMSCs 对失代偿期肝硬化患者的免疫调节作用尚无报道。我们观察了 42 例失代偿期肝硬化患者接受自体 BMSCs 治疗前后的免疫指标变化情况，结果发现：在干细胞治疗后随访的第 1、3、6、9、12月，患者外周血 IL-17 水平呈持续下降趋势（图 2），并且其下降趋势与肝功能恢复密切相关（图 3）。因此我们推测：BMSCs 可能通过下调患者体内 IL-17 水平促进

干细胞移植,失代偿期肝硬化,外周血,患者

失代偿期肝硬化患者经干细胞移植后外周血 IL-17 变动员前基线（Baseline）、动员后、移植术后 1、3、6、9-17 水平。*p<0.05、**p<0.01 干细胞移植后与动员前基化患者与正常对照组相比。

失代偿期肝硬化,干细胞移植,肝功能,患者

检测外周血 IL-17 水平。*p<0.05、**p<0.01 干细胞移植后与动员前基线相比，§p<0.05失代偿期肝硬化患者与正常对照组相比。图3. 失代偿期肝硬化患者经干细胞移植后肝功能改善和IL-17变化趋势虚线为正常低限值

【参考文献】