溃疡性结肠炎与腺瘤病变肠粘膜菌群分析及相关性研究

发布时间：2020-07-22 17:50

【摘要】：研究背景溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD),它是由多种原因引起的慢性和复发性肠道炎症。可影响大肠和回肠,临床表现为腹泻,腹痛,大便带粘液及脓血等,疾病反复发作多数可诱发息肉,腺瘤,甚至癌症。结肠直肠腺瘤是从腺上皮发生的一种良性肿瘤。它们可能存在于结肠的每一肠段中,并且在直肠和乙状结肠中更常见,通常被分为三种类型:管状,绒毛和混合型,是因为从组织学角度,它们有不同的形态特征,但不论哪种类型的腺瘤均存在不典型增生并具有恶变的倾向,也因此被认为是癌前病变。腺瘤转变为癌症的风险与其大小,数量,绒毛特征和组织分化程度密切相关[1]。结肠直肠腺瘤可以演变成结肠直肠癌(CRC)。一项研究发现,约80%的结肠直肠癌发生是由于结肠直肠腺瘤的发展,这个过程约需要5-10年[2]。因此,研究结直肠腺瘤发展到癌变的过程对发现结直肠癌发病机制具有重要意义。而且溃疡性结肠炎和结肠直肠腺瘤目前在其治疗中具有复发特征。从病因角度分析,引起所有消化系统疾病的病因中细菌往往是其中的一个。众多的研究中,目前公认的有:幽门螺杆菌感染是引起消化性溃疡的重要因素;食管炎症和肠上皮化生患者的食管粘膜菌群与健康者存在差异,因此食管炎症和肠上皮化生的发病跟菌群变化存在关联[3]。关于肠道菌群的研究越来越多,而且目前的研究已经逐渐认识到在消化系统各种疾病发病机制中菌群相互作用的重要性。已经发现功能性胃肠病的发病机制中有一条为:细菌是经过参与到肠道微生物群的代谢过程而引起疾病,故而相互作用是发病机制中的重要因素[4]。所以,目前认为宿主和肠道微生物群是共生的,消化系统疾病的发生肠道微生物群参与其中,但是宿主的基因,免疫和环境因素等会影响肠道微生物群的组成,肠道微生物也会在特定条件下破坏宿主的免疫和生理功能,导致病理改变,引起临床症状。人体内存在复杂的细菌,其中大多数是在胃肠道中,而在胃肠道中,绝大多数细菌又集中在结肠,结肠正是溃疡性结肠炎与息肉的最容易发病部位。人类肠道中含有约1014个细菌微生物,这些细菌基本上以菌群(microbiota)的形式生存,共包含500-1000个不同种群[5]。据估计这些微生物的基因数量是人类基因组基因数量的200倍[6]。不同结肠肠段的菌群含量不同,菌群组成也不同,并且肠腔和其相关联的粘膜上微生物菌群的数量和类型也是有差别的[7]。宿主能通过正常肠道菌群的存在得到获益,如正常菌群可有助于调节免疫系统[8],起到生物拮抗作用,帮助营养物质利用,促进维生素生物合成,保护粘膜[9]以及抗衰老作用。因此,保持正常菌群的合理存在有助于维持健康。菌群失调(dysbacteriosis),也就是肠道菌群紊乱,可能会导致或加重炎症,是因为一旦条件允许某些过路菌或条件致病菌明显增多成为有害细菌,打破了菌群平衡。研究还发现,诸如抗生素相关性腹泻[10],炎症性肠病[11-12],自闭症[13],肥胖[14]和肠易激综合征[15]等疾病都与菌群失调有关。从动力学角度,宿主的生理状态会严重影响肠道微生物菌群[16]。人类结直肠中大约存在着1014个细菌,如此庞大集体中的每个细菌必须为能从食物以及粘蛋白得到有限能量资源而展开激烈竞争[17]。肠道微生物菌群与宿主的生理状态在正常情况下保持着平衡。肠道上皮的杯状细胞分泌粘蛋白多糖供养粘膜相关菌群,杯状细胞分泌产生的粘液量和组成的不同又取决于肠道菌群的局部信号以及肠道菌群本身[18]。肠道菌群可以为宿主提供有益的营养性信号,也可能提供不利的信号,成为疾病的危险因素,因此肠道菌群及其形成的多样性和复杂性影响着肠内稳态和疾病状态[19]。如果宿主的粘膜生理状态发生了变化,如炎性改变,会产生一些作为额外电位受体的氧化产物,引起兼性厌氧菌的数量明显增加[20]。所以,宿主生理状态的改变可引起肠道菌群的紊乱,两者交互作用,进而导致出现病理改变。也就是肠道菌群与宿主之间的平衡一旦打破,菌群会通过能量吸收、内毒素血症、脑肠轴等多种途径影响宿主健康[21]。在溃疡性结肠炎和结直肠腺瘤时杯状细胞的密度和功能通常都会降低,肠道菌群会出现改变,但目前粘膜菌群改变与何种因素相关的详细研究仍然较少,需要进一步探索。近年以来,随着对肠道菌群越来越重视,关于菌群的文献资料数量也快速增长,这些研究主要基于16S rDNA序列分析[22],16S rDNA即核糖体16s小亚基基因(16S ribosomal subunit gene)。16S rDNA的碱基序列包含交错排列的可变区和保守区,保守区因其能够在进化过程中保持稳定,被用来设计细菌通用物;而可变区的差异可用来区分不同的细菌[23]。具体操作方法为收集肠粘膜或粪便样本,然后从中提取细菌的16S rDNA基因片段,按照标准操作程序,利用高通量测序技术获得其序列信息,然后比对16S rDNA数据库数据,在系统进化树上对该序列进行定位[24],以确定细菌的类型。高通量测序技术以其一次可并行大量测序及读长较短等优势被广泛应用,方法有很多,目前常用的包括:大规模平行签名测序法、聚合酶克隆法以及454焦磷酸测序法、MiSeq测序等。我们将利用454焦磷酸测序方法和MiSeq测序方法对肠粘膜内菌群进行研究分析。此外,肠道菌群具有潜在的诊断价值。Belcheva等[27]通过对结直肠癌相关细菌进行研究,发现细菌微生物及其代谢标志物可用于疾病的预测。Baxter等[28]对490例结直肠癌、结直肠腺瘤病人和正常对照的粪便样本利用16S rRNA基因测序的方法进行分析,构建随机森林模型,进而验证模型的效能,发现其诊断效能优异,受试者工作特征曲线下面积(Area under curve,AUC)为0.847。同课题组研究人员采用同样的方法对404名结直肠癌病人粪便标本研究,构建诊断模型,AUC为0.853[29]。Zeller等[30]对156名参与者的粪便样本利用宏基因组测序技术进行分析,构建诊断模型,AUC为0.84。在本研究中我们将基于肠粘膜菌群的分析,利用机器学习方法建立模型预测结直肠腺瘤,以探讨肠粘膜菌群的诊断价值。近年来机器学习方法逐渐被应用于临床诊断。机器学习方法就是一个从样例归结到计算机程序的过程,它具有强大的学习能力和推广能力,学习能力为利用已知数据和知识从而发现规律。推广能力为通过学习发现的规律不但能解释已知数据和知识,还能对未知数据进行严谨的预测和判断。它的操作过程为掌握已知数据,然后通过设计算法以及模型进行学习,发现内在的联系,进而对未知的数据进行预测和判断。支持向量机(Support Vector Machine,SVM)[31]是机器学习方法中的一种算法,它的优势体现在:小样本研究、非线性以及高维模式识别。SVM能够通过对有限的样本信息进行分析获得最大的推广能力。参数选择主要有三种方法:经验法[32-33];实验法,主要有交叉验证法[34];理论法,主要指基于函数集VC维的算法[35]。目前能否应用机器学习通过粘膜菌群的组成来判断病变类型尚无研究。我们首次采用机器学习方法中的支持向量机算法判别腺瘤与非腺瘤病灶,并比较两者准确率与鲁棒性。共聚焦激光显微内镜(Confocallaserendomicroscopy,CLE)的原理是把共聚焦激光显微镜与传统消化内镜融合在一起,采集到的图像可以放大至1000倍。使用荧光素钠作为造影剂可以在传统内窥镜检查过程中对消化道粘膜进行实时“光学活检”,以准确快捷地得到可以与组织活检媲美的图像。目前,新型共聚焦激光显微内窥镜已经发展成探针类型。它可以灵活地插入常见的消化道内窥镜活检通道,收集肠粘膜的实时图像。在探头移动期间,能够清晰地观察到一定深度的组织和细胞。所以,CLE检查时不仅能够获得组织的图像,还能够观察粘膜上皮的生理病理状态。CLE可用各种指标来评估肠黏膜的病理生理状态,如:上皮完整性[36-37],新血管生成[38-39]和炎性渗出[40]等。在CLE下溃疡性结肠炎的特征可能表现为:隐窝的不规则排列,隐窝大小和数量的变化,隐窝融合,荧光素渗出和隐窝脓肿等。不同分期的特征会有所不同。多项与病理学对照的研究发现共聚焦激光显微内镜对溃疡性结肠炎炎症活动度的诊断准确性、可行性均较高[40-42],其中Li等发现CLE可以准确判断UC的炎症活动程度;隐窝结构、微血管改变和荧光素渗漏是CLE下判断UC炎症活动程度的主要依据[40]。在CLE下,结肠直肠腺瘤主要呈现为结构上改变,包括不规则或绒毛状隐窝,改变了的隐窝/间质比例,隐窝被破坏,血管形态(包括直径,数量,形态等)的变化以及荧光素渗出等,其次还有细胞的变化,包括上皮细胞异型,细胞极性变化,杯状细胞减少甚至消失等。Kiesslich等人[43]观察结肠镜检查患者,如果在过程中发现结肠息肉,则进一步行CLE检查,并根据上皮细胞形态,血管结构和隐窝类型对CLE图像进行前瞻性评估,对结肠息肉取活检,将CLE图像与病理图像比对。研究发现CLE图像和活检标本的病理结果存在高度一致性,而且灵敏度、特异性以及准确性都很高,因此,CLE能够用来预测新生物。同课题组进一步研究将5580幅共聚焦图像与组织病理学结果比较,发现共聚焦预测瘤变的敏感性、特异性和准确性分别为94.7%、98.3%和97.8%[44]。所以,在CLE下可以很容易地判断UC的炎症活动程度和结直肠腺瘤的类型,也就是粘膜的病理生理状态,从而做出内镜诊断。另外,CLE的主要优势之一还表现在体内评估和非侵入性。因此,CLE可用于鉴定目标粘膜,靶向活检,进而对细菌进行测序和分析。在这项研究中,我们利用共聚焦激光显微内镜对溃疡性结肠炎和结肠直肠腺瘤做出诊断。靶向获取病变部位粘膜,同时从正常部位粘膜取标本作为对照,利用高通量测序技术对收集的粘膜菌群16S rDNA基因序列进行提取,在此基础上进行物种注释,对肠粘膜菌群进行差异性分析,构建进化树,并探讨肠粘膜菌群的诊断价值。目的本研究旨在就不同疾病状态和不同活检部位的肠粘膜菌群组成进行差异性分析,并探讨肠粘膜内菌群的诊断价值。方法本研究的研究对象选择是2013年11月至2017年7月期间在山东大学齐鲁医院做高清结肠镜检查的患者。符合纳入标准的受试者按常规使用高分辨率白光内镜进行检查,在检测到病灶后,进一步行pCLE检查。病变部位和相邻的正常对照部位均采用相同的方法检查,并于内镜下进行诊断。将诊断的病变和正常粘膜取活检,并且使用标准清洗方法以除掉粘膜表面上附着的细菌及粪便,标本被冷冻保存。按批次将粘膜标本的细菌DNA使用16S rDNA高通量测序方法测序。高通量测序数据返回后做基本处理,再采用mothur软件分析,聚类0TU,进行物种注释,按照取材部位和共聚焦内镜下的诊断类型比较肠粘膜菌群间的整体差异,构建16s rDNA的进化关系,利用SVM方法判别腺瘤与非腺瘤病变,验证肠粘膜菌群16s rDNA测序数据是否有诊断价值。结果在这项研究中,共筛查了 771名患者,并将其中的78名患者纳入研究组进行最终数据分析。粘膜菌群经高通量测序并处理后得到1,992,098条有效序列。按照0.97相似性聚类得到8,151个0TU,并进行物种注释。对粘膜菌群的差异性分析表明肠粘膜活检部位和病变类型均能影响肠粘膜菌群的组成,且活检部位的影响更大。构建出肠粘膜菌群16s rDNA基因的整体进化关系图,该图显示了菌群之间的进化关系。每一个小分支是一个OTU的代表性序列,越靠近末端表示相邻之间关系越近。肠粘膜菌群16s rDNA测序数据具有潜在的诊断价值。结论共聚焦激光显微内镜是一个有用的工具,可用于评估人类在体粘膜的病理生理状态,有助于疾病早期诊断,方便靶向活检。肠粘膜活检部位和病变类型均能影响肠粘膜菌群的组成。肠粘膜菌群16s rDNA测序数据具有潜在的诊断价值。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574.62
【图文】：

菌种,钟形,进化树,序列

采用距离依靠法计算两两序列间的差异，构建肠粘膜菌群１６ｓ邋ｒＤＮＡ基因的整体逡逑进化关系，并以ＦｉｇＴｒｅｅ软件（Ｖｅｒｓｉｏｎ邋１．４．２）进行可视化绘图，分别以钟形图和逡逑树形图表示，见图４。该系统进化树展现了所得到的物种之间的关系，每条终端逡逑线段代表一个独特序列，拥有各自的物种名称，因其过于庞大，且在该研究中未逡逑对具体菌种展开分析，因此在绘制进化树时将菌种名称省去。线段长度代表与邻逡逑近序列间的差异。越靠近末端表示相邻之间的进化关系越近。系统进化树的建立逡逑有利于进行序列同源性分析，方便研究未知菌种与其他菌种的亲缘关系。逡逑图４构建肠粘膜菌群１６ｓ邋ｒＤＮＡ基因的整体进化关系。分别以钟形图（左）和树逡逑２８逡逑

【参考文献】