HBVcccDNA滚环扩增检测方法的建立

发布时间：2020-07-22 19:33

【摘要】：目的乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)是HBV基因复制和合成的模板,也是抗病毒治疗结束后乙型肝炎复发的主要原因。本研究旨在建立滚环扩增(Rolling Cycle Amplification,RCA)方法,检测HBV cccDNA,研究此方法的特异性及敏感性,探索其临床意义及应用价值。 方法以HBV全基因质粒为模板,经酶切、连接、浓缩、胶回收纯化等步骤,构建和制备HBV cccDNA标准品,作为研究中的阳性对照DNA模板。用Qiagen试剂盒抽提慢性乙型肝炎患者肝组织标本总DNA,并经Plasmid SafeTM ATP dependent Danse(PSAD)酶处理,以此为模板,进行滚环扩增。用HBV cccDNA标准品、3.2Kb线性HBV DNA、正常肝组织及15例慢性乙型肝炎患者血清作为对照,分别以琼脂糖凝胶电泳和Southern Blot印迹核酸杂交两种方法验证此方法的特异性。将HBV cccDNA标准品进行系列稀释,了解该方法的敏感性。 结果本研究成功构建了HBV cccDNA,并可用RCA方法进行扩增;RCA方法可从少至2mg的慢性乙型肝炎患者的肝组织中检测到HBV cccDNA;该方法可检测低至102拷贝的HBV cccDNA分子;RCA方法不能检测3.2Kb线性HBV DNA;在正常肝组织及15例乙肝患者血清中检测不到HBV cccDNA。结论RCA方法操作较方便,具有很高的特异性和敏感性,可为肝细胞核内HBV cccDNA多态性的分析、研究提供基础,同时为临床上慢性乙型肝炎患者治疗过程中发生耐药机制的研究提供实验依据,具有较高的临床意义及应用价值。
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R512.62;R440
【图文】：

图1 HBV cccDNA构建(1A)及跨rcDNA缺口区PCR扩增（1B）：图1A中显示了三种连接产物，Marker分子量标记为2.1Kb的DNA即为HBV cccDNA为线性DNA，6.4Kb的DNA为DNA双体。图1B中以三种HBV DNA为模板，用跨rcDPCR扩增，3.2Kb线性DNA无产物。M：Marker；1:6.4Kb线性DNA；2：3.2Kb线性D,4：H2O。2A 2Bp M 1 2 1 2 M bp0→←6000

2A 2Bbp M 1 2 1 2 M bp图2 构建的HBV cccDNA RCA产物（2A）及RCA产物酶切鉴定（2B）注：图2A:以构建的HBVcccDNA为模板滚环扩增，均可见扩增产物；图2B：将滚环扩增产物单酶切，标准HBV cccDNA为模板的产物酶切后可见3.2KB条带；以H2O为对照，未见有3.2KB条带，M：Marker; 1:H2O; 2: HBVcccDNA模板6000 →3000 →2000 →← 6400← 3200← 21002000 →500 →10000→←6000←3000←2000

图3 RCA反应特异性分析注：RCA产物（3A）及RCA产物单酶切（3B），M: Marker, 1：HBV cccDNA标准品，2：HBV.2Kb线性DNA，3：经PSAD酶消化的正常对照肝组织总DNA，4：经PSAD酶消化的乙肝组织总DNA，：血清总DNA，6：H2OM 1 2 3 4 5 64.0Kb →3.2Kb →

【共引文献】

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本文编号：2766259