HSP70-FTO轴在非酒精性脂肪性肝病中的作用及机制研究

发布时间：2020-07-23 23:40

【摘要】：非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是遗传-环境-代谢应激相关性疾病,发病机制尚未完全明了。热激蛋白70(heat shock protein,HSP70)在大多数生物中含量最多,在应激反应中最为敏感。肥胖相关基因(fat mass and obesity associated gene,FTO)在NAFLD中表达上调,促进NAFLD的发展。研究发现在热激的情况下,敲低FTO能促进HSP70的合成。本实验旨在观察HSP70-FTO轴在NAFLD发病过程中的作用,期望为NAFLD的防治提供新的思路。本课题通过以下三部分探究了HSP70与FTO之间的关系,及其在NAFLD中的作用及机制。一、HSP70和NAFLD之间的关系目的:探讨HSP70在NAFLD人群血清、NAFLD小鼠肝脏以及棕榈酸(PA)诱导的人肝癌HepG2细胞脂肪变性模型中的表达水平。方法:ELISA检测NAFLD人群血清中HSP70表达水平的变化;用高脂饲料制备NAFLD小鼠动物模型,qPCR、Western blot及免疫组织化学方法检测HSP70的表达及组织学定位;0.5mM PA作用人肝癌HepG2细胞24 h诱导脂肪变性模型,qPCR及Western blot检测HSP70表达水平。结果:NAFLD人群血清中HSP70表达明显增加,且与BMI、腰围、血清ALT之间呈显著正相关;免疫组化及Western结果显示,HSP70在高脂诱导的NAFLD小鼠肝脏中表达上调且入核增多;在HepG2细胞脂肪变性模型中,HSP70mRNA及蛋白水平在PA作用下表达显著增高。结论:HSP70在NAFLD中表达上调,可能与NAFLD的发病过程有密切关系。二、HSP70对NAFLD的作用目的:探讨HSP70在NAFLD中的功能及作用方法:体外实验:慢病毒转染Lenti-HSPA1A及Lenti-Vector过表达HSPA1A,油红O染色判断细胞内脂滴,ELISA检测细胞上清内甘油三酯(TG)及胆固醇(TC)水平,qPCR检测细胞内脂肪合成相关酶FAS、SCD、ACC、SREBP1C、脂肪分解相关酶ACOX、CPT-1、PPARα的mRNA水平;再给予PA刺激24 h后检测上述指标变化;慢病毒转染Si-HSPA1A及Si-Vector干扰HSP70,油红O染色判断细胞内脂滴,ELISA检测细胞上清内甘油三酯(TG)及胆固醇(TC)水平,qPCR检测脂肪合成相关酶FAS、SCD、ACC、SREBP1C、脂肪分解相关酶ACOX、CPT-1、PPARα的mRNA水平;再给予PA刺激24 h,检测上述指标变化。体内实验:正常饮食小鼠分为两组:(1)NFD+AAV-CTL组,(2)NFD+AAV-HSPA1A组;高脂喂养小鼠16周后分为两组:(1)HFD+AAV-shCTL组,(2)HFD+AAV-shHSPA1A/1B组;监测各组小鼠体重,HE及油红O染色判断肝脏脂肪变性。结果:体外实验:与仅稳定表达空慢病毒载体的细胞相比,HSP70过表达略微增加了HepG2细胞中脂滴的数量,在0.5mM PA作用24h后HSP70过表达的细胞中的脂滴数量比仅用慢病毒载体表达的细胞数量明显增加,而对照组的细胞中的脂滴数量明显增加。在细胞中过表达HSPA1A上清液的TG水平略有增加,而在细胞中过表达HSPA1A上清液TC水平显著增加,过表达的慢病毒载体的细胞与对照组相比,变化不大。在PA处理后,细胞过表达HSP70,TC和TG的分泌明显增加。此外,脂肪合成相关酶如FAS,SCD,ACC和SREBP1C以及脂肪分解相关酶如ACOX,CPT-1,和PPARα的mRNA水平用定量PCR进行检测,ACC和SREBP1C的mRNA水平在HSPA1A过表达的细胞中表达显著增加,无论是否用PA进行处理细胞,PPARα在HSPA1A过表达细胞用PA进行处理时表达下降。当HSP70被敲低时,与对照组与空白转染组细胞相比,HSP70敲减后HepG2细胞中的脂滴数量没有显著差异。在PA处理后,HSP70敲减细胞显示的脂质小滴比对照组与空载组细胞的脂滴少。在siHSPA1A转染细胞与对照组细胞相比,在HepG2细胞培养上清的TG和TC水平明显降低,无论是否用PA进行处理。我们对与脂肪合成有关的酶FAS、SCD、ACC、SREBP1C以及与脂质分解相关酶ACOX、CPT-1、PPARα的mRNA水平用定量PCR进行检测。FAS,SCD与ACC在低表达HSPA1A细胞中显著降低。同时也发现在PA处理后,FAS,SCD,ACC和SREBP1C的mRNA水平在敲减HSPA1A细胞中依然很低,另外CPT-1在PA处理后表达增高。体内实验:正常组的小鼠肝脏HE及油红O染色切片无明显病理变化,过表达HSPA1A组的肝脏切片也基本无明显变化。小鼠给予高脂饲料喂养16周,行鼠尾静脉注射AAV介导的同时干扰HSPA1A/B载体,在3周后病毒达到作用高峰,取肝脏组织,行HE染色发现高脂+AAV-shCTL组小鼠肝脏组织内内出现大量脂肪变性,尤其是汇管区域有炎症细胞浸润伴有部分点状肝细胞坏死;在高脂+AAV-shHSPA1A/B组的小鼠肝脏组织内脂肪变性程度有所减轻,炎症细胞浸润及肝细胞坏死程度也有所减轻。与此同时油红O染色发现:高脂+AAV-shCTL组小鼠肝脏组织内内出现大量脂滴弥散分布于整个肝脏,脂滴形状较大,数量多满视野;在高脂+AAV-shHSPA1A/B组的小鼠肝脏组织内脂滴数量有所减少,脂滴形状有所减小,以汇管区减少较为明显,说明肝脏组织脂肪变性程度有所减轻。而各组小鼠体重在病毒注射前后变化不明显。结论:HSP70促进脂质合成增加进而促进NAFLD的发病过程,敲低HSP70使NAFLD的脂肪变性程度减轻。说明HSP70在NAFLD发病的过程中发挥重要作用。三、探讨HSP70-FTO轴在NAFLD中的作用及机制研究目的:探讨HSP70-FTO轴在NAFLD中的作用及机制研究方法:通过Western blot,共聚焦及等方法观察HSP70对FTO的调控和共定位关系以及通过GST-pull down的方法进一步验证HSP70和FTO之间的关系。通过慢病毒转染Lenti-FTO及Lenti-Vector过表达FTO,以及通过慢病毒转染si-FTO及si-Vector敲低FTO分别采用油红O染色判断细胞内脂滴,ELISA检测细胞上清内甘油三酯(TG)及胆固醇(TC)水平,qPCR检测细胞内脂肪合成相关酶FAS、SCD、ACC、的mRNA水平;再给予PA刺激24 h,观察其对脂质合成的影响。结果:体内实验:在小鼠肝脏中过表达HSP70促进FTO表达水平增高。体外实验:我们发现过表达HSP70促进FTO表达水平增高,在PA干预24 h后蛋白水平增加。敲低HSP70能够降低FTO表达水平,在PA干预24 h后蛋白水平较干预前增加。共聚焦结果分析表明,HSP70和FTO分布在正常情况下分布在细胞胞浆,在0.5 mM PA作用24h后HSP70和FTO蛋白富集在细胞核中,表明这两种蛋白的活化。当HSP70被敲低后,FTO在细胞质中,当给定0.5mM的PA刺激后,FTO富集在细胞质膜和核膜,除了核。同样在FTO敲低后,HSP70停留在细胞胞浆,但在0.5mM的PA刺激下,HSP70在细胞核中增多。综上,这些结果表明,HSP70促进FTO核转移。GST-pull down显示:GST-FTO,His-HSP70蛋白纯化后,GST-pull down,GST-FTO结合HSP70,而GST蛋白不能结合HSP70,以上说明HSP70可以直接结合FTO。而且过表达FTO细胞内脂滴与对照组相比轻微增多,在过表达FTO的基础上再用0.5mM的棕榈酸干预24h细胞内脂滴明显增多。过表达FTO细胞上清内TC、TG含量增多与对照组相比,在过表达FTO的基础上再用0.5mM的棕榈酸干预24h细胞上清内TC、TG含量明显增多。过表达FTO细胞内脂质合成相关酶FAS,SCD及ACC mRNA表达水平增高与对照组相比,在过表达FTO的基础上再用0.5mM的棕榈酸干预24h后,其水平增加不明显。与此相反的是敲低FTO能减少细胞内脂质合成。结论:HSP70能上调NAFLD中FTO的表达。HSP70能直接结合FTO并且HSP70在高脂的作用下促进FTO核内转移。表明HSP70通过调控FTO参与NAFLD的发病过程。HSP70-FTO轴与NAFLD的发病过程密切相关。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575
【图文】：

人体血清,相关性,生化特征,临床研究

三者与 HSP70 之间相关性分别是 BMI (r = 0.18r = 0.1498, P =0.0062），血清 ALT（r = 0.1357, P =0.0131）。因LD 具有密切关系。表 1. 临床研究对象的临床和生化特征acteristics Control group NAFLD group Pber of subjects 167 167years) 57.63±0.6968 58.16±0.12 0，n(%) 86(167) 79(167)kg/m2） 23.53±0.19 27.03±0.31 <mmHg) 128.6±1.34 136.6±1.3 <mmHg) 74.04±0.77 80.40±0.77 <umol/l） 312.2±6.58 353.4±6.95 <mmol/l） 4.95±0.06 5.05±0.08 0mmol/l） 1.66±0.11 2.46±0.16 <（mmol/l） 1.51±0.03 1.27±0.02 <mmol/l） 2.68±0.05 2.83±0.06 0U/L） 20.05±0.8 32.12±1.58 <

高脂,气球样变性,无脂肪,高脂饮食

上海交通大学 2015 级博士学位论文Figure 1-1.The association of serum HSP70 levels with human NAFLD. Serum HSP70 levels wereassayed by ELISA in normal individuals (n=167) and NAFLD individuals (n=167). **P < 0.01，vs.Control.3.2. NAFLD 小鼠肝脏组织内 HSP70 的表达3.2.1. 小鼠肝脏 HE 染色结果小鼠肝脏组织 HE 染色结果显示, 正常饮食组的肝小叶纹理结构清楚，无脂肪变性。高脂饮食组小鼠肝脏小叶内出现脂肪变性，大量气球样变性的空泡，特别是汇管区域有炎症细胞浸润以及部分点状坏死的肝细胞（如图 1-2）

脂肪变性,高脂,免疫染色,模型

24图 1-3 HSP70 在 NAFLD 小鼠肝脏中表达上调。HSP70 在正常组与高脂组中的表达（A,免疫染色×200，×400）,Western blot 检测组织内 HSP70、GAPDH 的蛋白水平（B）。（C）对条度值进行定量。与对照组相比，* P<0.05Figure 1-3 The expression of HSP70 was up-regulated in the liver of NAFLD mice. Expression of HSP70 in ngroup and high fat group (A, immunohistochemical staining x 200, x 400),Western blot was used to test HSP70 pexpression(Figure 1-6B). HSP70 protein (Figure 1-6C) expression levels were evaluated by Western-blot and normto GAPDH levels. * P<0.05 compared with the control group.3.3. HSP70 在 PA 诱导的 HepG2 细胞脂肪变性中表达上调为了进一步在体外探讨 HSP70 在脂肪变性模型中的作用，我们利用 0.5mM PA HepG2 细胞 24 h 诱导脂肪变性模型，实时定量 PCR 测定 HSPA1AmRNA（A）, Weblot 检测组织内 HSP70、GAPDH 的蛋白水平，我们发现 HSP70 在 HepG2 细胞脂

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