肠道炎症在非酒精性脂肪性肝炎中的作用及其相关机制的研究

发布时间：2020-07-24 04:24

【摘要】：背景和目的尽管已有研究报道“多次打击”参与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的发生和进展,但NAFLD进展至非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的相关机制目前尚未完全清楚。近年来,越来越多研究将肠道微生物,肠道屏障完整性和NAFLD联系起来。临床资料显示,肠道炎症常与肝脏损伤有关,如炎症性肠病(IBD)常伴有NAFLD。肠道菌群失调可引起肠道炎症和肠道屏障损伤,随后肠道细菌及其产物和有毒物质及炎症介质的易位可促进肝脏损伤,故肠道屏障功能障碍在NAFLD的发生发展过程中起关键作用。因此,在NAFLD/NASH的发展过程中,肠道屏障破坏是肠肝轴的炎症转运和肝脏免疫持续激活的重要机制。众所周知,肠道黏膜屏障起到了阻止肠道微生物侵入的第一道防线作用。最新的研究发现,除了肠道黏膜屏障之外,还存在抵抗肠道微生物的第二道防线-肠血管屏障(GVB)。GVB可以控制外来抗原进入体内,防止肠道细菌易位及其全身播散。而且,研究证实肠道血管屏障(GVB)损伤可能是导致乳糜泻患者肝脏损伤的重要原因。然而,目前还没有临床和实验研究来证实GVB在NAFLD/NASH中功能。本研究通过建立伴有肠道炎症损伤的NAFLD模型,研究肠道炎症对高脂饮食诱导的NAFLD模型肝脏损伤的影响,并明确肠道炎症加重肝脏损伤的机制;同时观察肠道屏障损伤和肠道菌群移位情况,并进一步证明GVB功能障碍及肠肝轴异常在NAFLD进展中的作用。方法1.通过喂食C57BL/6小鼠葡聚糖硫酸钠(DSS)和高脂饮食(HFD)12周,建立肠道炎症损伤的NAFLD模型,随机分为四组:正常饮食组(Con),高脂饮食组(HFD),DSS组和HFD+DSS组。通过疾病活动度评分(DAI)、结肠形态学变化和结肠组织活动度评分(HAI)来评估结肠炎症损伤情况,并用RT-PCR方法检测结肠组织炎症因子IL-1和TNF-α的mRNA表达。应用油红O染色观察小鼠肝脏脂肪变性程度,HE染色观察小鼠肝脏组织病理损伤情况,同时Masson染色观察小鼠肝脏纤维化病变情况。RT-PCR方法检测各组小鼠肝组织中的炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α、MCP-1的表达情况以及促纤维化因子Collagen 1、ACTA2、TGF-β、PAI-1和TIMP-1的表达情况。Western blot方法检测小鼠肝脏组织中Collagen 1蛋白的表达情况。2.通过终点显色法鲎试剂检测了各组小鼠门静脉内毒素的含量,此外用RT-PCR方法检测各组小鼠肝脏中模式识别受体TLR-4和TLR-9的表达情况。Western blot方法检测各组小鼠结肠黏膜紧密连接相关蛋白ZO-1和Claudin 1的表达情况。为了评估肠道血管屏障通透性,我们将2mg FITC-dextran 70KD(FD70)注射入小鼠结肠袢中,通过荧光显微镜观察肝脏和脾脏中FD70荧光素的分布情况和同时用荧光酶标仪测定血清中FD70荧光素的含量。另外,通过Western blot方法检测肠血管屏障通透性指标质膜囊泡相关蛋白PV 1的表达情况,并用免疫荧光共聚焦方法进一步检测结肠组织PV-1的表达和分布情况。结果1.与对照组相比,DSS组和HFD+DSS组小鼠体重明显降低,DAI评分显著增加,结肠明显缩短,结肠黏膜损伤(隐窝和杯状细胞减少、隐窝扭曲、黏膜下水肿和炎症细胞浸润)及组织病理评分显著增加。此外,PCR检测显示DSS组和HFD+DSS组结肠中促炎症因子IL-1、TNF-α表达显著升高。油红O染色显示HFD组肝脏出现明显的脂滴,而HFD+DSS组肝脏内脂滴沉积更为明显。HE肝脏组织学检测显示,HFD组和HFD+DSS组肝脏结构紊乱,出现大量的脂肪空泡,而且HFD+DSS组肝脏还伴有炎症细胞浸润。与肝脏组织病理结果一致,HFD+DSS组肝脏促炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α和MCP-1的mRNA表达显著增加。Masson染色显示HFD+DSS组肝脏出现少许纤维组织沉积。与HFD组相比,HFD+DSS组肝脏中Collagen I蛋白的表达增加。而且,HFD+DSS组小鼠肝脏促纤维化因子Collagen 1、ACTA2、TGF-β、PAI-1和TIMP-1 mRNA的表达也增加,且明显高于HFD组。另外,Spearman相关性分析表明,模型小鼠DAI评分和HAI评分与小鼠肝脏病变严重程度呈显著正相关(r=0.813,P0.01;r=0.930,P0.01)。2.通过内毒素鲎试剂检测门静脉血浆内毒素水平,结果显示HFD+DSS组门静脉内毒素水平较HFD组和DSS组具有升高的趋势,但差异没有统计学意义。RT-PCR结果显示,HFD+DSS组肝脏中TLR4和TLR9的表达明显高于其他三组。Western Blot检测显示,DSS组和HFD+DSS组结肠黏膜紧密连接蛋白ZO-1、Claudin1的表达较对照组明显减少。肠血管屏障通透性检测结果显示,HFD+DSS组肝脏脾脏内FD70的荧光密度较HFD组和DSS组显著增加,且HFD+DSS组血清中FD70荧光素的含量较对照组也明显增加。Western blot检测显示,相比于正常组和HFD组,DSS组和HFD+DSS组结肠中PV-1蛋白的表达明显升高。免疫荧光共聚焦结果显示,DSS组和HFD+DSS组结肠中PV-1的表达增加,而且HFD+DSS组结肠中PV-1的表达增加较HFD组更明显,这与western blot结果相一致。另外,PV-1(红色荧光标记)与血管内皮细胞CD31(绿色荧光标记)的表达位置有重叠,表明PV-1蛋白定位于肠黏膜微血管内皮细胞。Spearman相关性分析表明,模型小鼠结肠PV-1蛋白水平与小鼠肝脏病变严重程度呈显著正相关(r=0.868,P0.01)。结论肠道炎症加重高脂饮食诱导的NAFLD模型小鼠肝脏炎症和纤维化损伤,并促进NASH发生。除了受损的肠道黏膜屏障外,肠血管屏障破坏和菌群移位或内毒素血症可能在NASH的发病机制中发挥重要作用。更重要的是,本研究证实了GVB在NASH发病机制中的重要作用,并进一步突出了饮食因素、肠道屏障和肠道微生物在推动NAFLD进展过程中的复杂作用。了解肠道血管屏障可能为肠-肝轴的调节提供新的见解,从而为预防和治疗NASH提供潜在的治疗靶点。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.1
【图文】：

示意图,高脂饮食,结肠炎,小鼠

TEMED 4ul2.动物模型的建立和实验分组SPF 级 C57BL/6 小鼠 40 只随机分为四组，每组 10 只，分别为正常组、HFD 组、DSS 组和 HFD+DSS 组。正常组小鼠进食普通饲料和饮用蒸馏水；高脂饮食组小鼠进食含 60%脂肪供能的 D12492 高脂饲料和饮用蒸馏水；DSS 组小鼠进食普通饲料和饮用含 1% DSS的蒸馏水；HFD+DSS 组小鼠进食含 60%脂肪供能的 D12492 高脂饲料和饮用含 1% DSS的蒸馏水。四组小鼠共饲养 12 周，其中 DSS 组和 HFD+DSS 组小鼠，先饮用 1% DSS 溶液 7 天，然后改为饮用正常水 10 天，此为个周期，共进行五个周期；正常组和高脂饮食组小鼠同样饮用相应天数的蒸馏水，建模示意图见图 1。12 周后隔夜进食，次日给与 1%戊巴比妥腹腔注射麻醉，取出肝脏和结肠组织，检测各组结肠的长度，留取部分肝脏和结肠组织标本做相应的检测，余下的标本放入-80℃的低温冰箱中保存。

高脂饮食,实验过程,模型小鼠,变化曲线

随造模时间的延长，小鼠体重稍微增加但小鼠体重总体趋势下降(见图2)。1.2 模型小鼠结肠炎症损伤的评估1.2.1 模型小鼠体重变化趋势在实验期间，我们检测各组小鼠每周的体重变化，并计算小鼠每周体重占初始体重的百分比（图 2）。正常组小鼠体重缓慢增加，到 12 周实验结束时较前增加为 121.32%±11.69%；HFD 组小鼠体重随造模时间的延长逐渐增加，到造模结束时，小鼠体重较初始体重增加为 139.77%±7.24%。DSS 组小鼠在小鼠体重在前两周下降，在第二周下降最明显（97.59%±10.24%），随着造模时间延长，DSS 组体重缓慢增加，至造模结束时体重增长为 109.83%±6.72%；HFD+DSS 组小鼠体重在前三周下降，在第三周下降最明显（91.08%±11.18%）

模型小鼠,结肠,小鼠,长度缩短

型小鼠疾病活动度（DAI）的评分和四组间 DAI 评分的比较（*P<0.05型小鼠结肠长度的评估模结束后处死小鼠，从四组小鼠中剪取结肠并进行长度测量。结果显结肠最短（5.59±0.34cm），正常组小鼠结肠最长（7.75±0.63cm）相比，HFD+DSS 组和 DSS 组（5.83±0.50cm）小鼠结肠明显缩短，义（P<0.01），而HFD组（6.74±0.77cm）结肠长度缩短，但无统计学意D 组相比，HFD+DSS 组小鼠结肠长度明显缩短，具有统计学意义（P>0.，HFD 组结肠长度相差不大，无统计学意义（P>0.05）（图 4-5）。

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