STF-083010在硫代乙酰胺诱导的小鼠肝损伤中的作用研究

发布时间：2020-07-24 11:54

【摘要】：背景和目的由毒素或药物引起的急性肝损伤是威胁患者生命的常见疾病。在西方国家,药物性肝损伤(Drug induced liver injury,DILI)是急性肝衰竭和肝脏移植的重要原因之一。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在多种不同原因引起的肝损伤中,发挥重要调节作用,是肝脏疾病机制研究的新热点。肌醇依赖酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)是最保守的ERS传感器。IRE1α磷酸化激活后,可以通过其核糖核酸内切酶活性,特异性地剪切X-BOX结合蛋白1(x-box binding protein 1,XBPl)mRNA,产生强促转录作用的sXBPl转录因子。sXBPl启动下游相关基因转录表达,从而阻止错误蛋白质翻译或促进蛋白质正确修饰以缓解ERS。IRE1α-XBP1信号是ERS重要调控通路。STF-083010是IRE1α核糖核酸内切酶特定抑制剂,可特异性阻断IRE1α-XBP1信号通路。近年研究显示,STF-083010在多种肝损伤模型中具有抗氧化、抗炎症作用。然而,STF-083010对硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)诱导的急性肝损伤是否具有保护作用尚不清楚。因此,本文拟探讨STF-083010是否对TAA诱导的小鼠肝损伤发挥保护作用,以及其相关机制。方法1.建立TAA诱导的小鼠急性肝损伤模型。体内实验验证IRE1α-XBP1信号通路参与TAA诱导的肝损伤6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠,随机分成TAA组(n=6)、CON组(n=6)分别腹腔注射200 mg/Kg中毒剂量硫代乙酰胺(TAA)及等体积PBS。TAA组小鼠分别于0,6,12,24 h时间节点处死。分别收集小鼠血清及肝脏组织。应用全自动生化分析仪检测小鼠血清ALT、AST水平;取部分小鼠肝组织置入10%中性福尔马林溶液中固定,用于苏木素-伊红(haematoxylin and eosin,HE)染色观察肝脏组织变性坏死情况;蛋白免疫印迹(Western blot)测定IRE1α,p-IRE1α,sXBP1表达情况。2.体内实验验证STF-083010对TAA诱导的急性肝损伤、ROS及炎症反应影响6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分4组:TAA组(n=12)腹腔注射500 mg/Kg致死剂量TAA;TAA+STF(30mg/kg)组(n=12)予TAA处理前2小时腹腔注射STF-083010(30mg/Kg);TAA+STF(50mg/kg)组(n=12)予TAA处理前2小时腹腔注射STF-083010(50mg/Kg);TAA+STF(70mg/kg)组(n=12)予TAA处理前2小时腹腔注射STF-083010(70mg/Kg),生存实验对比4组死亡率,并确定STF-083010干预有效浓度。在肝损伤实验中,6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分成4组:CON组(n=6)腹腔注射等体积PBS;TAA组(n=6)腹腔注射200 mg/Kg中毒剂量TAA;STF组(n=6)腹腔注射STF-083010(50mg/Kg),TAA+STF组(n=6):200 mg/Kg TAA处理前2小时腹腔注射STF-083010(50mg/Kg),予24小时节点处死小鼠,分别收集小鼠血清及肝脏组织。使用全自动生化分析仪检测各组血清中ALT、AST水平;采用HE染色观察各组肝脏组织变性坏死情况,TUNEL法观察比较各组肝细胞凋亡变化。DHE染色法测定各组肝脏ROS生成情况。qRT-PCR检测各组肝脏组织中促炎细胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β表达情况。3.体内实验验证STF-083010在TAA诱导肝损伤小鼠中是否触发自噬及其调控靶点6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分成6组:CON组(n=6)腹腔注射等体积PBS;TAA组(n=6)腹腔注射200 mg/Kg中毒剂量TAA;STF组(n=6)腹腔注射STF-083010(50mg/Kg);TAA+STF组(n=6):200 mg/Kg TAA处理前2小时腹腔注射STF-083010(50mg/Kg);CQ组(n=6):腹腔注射CQ(60mg/Kg);TAA+STF+CQ组(n=6):200 mg/Kg TAA处理前2小时腹腔注射STF-083010(50mg/Kg),前1小时腹腔注射CQ(60mg/Kg).予24小时节点处死小鼠,收集血清及肝脏组织。Western blot测定各组p-IRE1α,sXBP1,LC3B,p62,Beclin-1表达情况。选取CON组、TAA组、TAA+STF组及TAA+STF+CQ组为研究对象,应用全自动生化分析仪测定血清ALT、AST水平;采用HE染色观察各组肝脏组织变性坏死情况,TUNEL法观察比较各组肝细胞凋亡变化。DHE染色法测定各组肝脏组织ROS生成情况。qRT-PCR检测各组肝促炎细胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β。4.体外实验证实STF-083010通过促进自噬改善TAA诱导肝细胞氧化应激和肝毒性分离培养小鼠原代肝细胞。为了验证STF-083010是否对TAA处理肝细胞具有保护作用。给予原代肝细胞不同浓度TAA处理后(0,10,20,30,40,50,60,70,80及90μM),在添加/不添加STF-083010(10mM)干预条件下,常规培养6h。CCK-8法测定肝细胞活力,拟合函数曲线,计算TAA半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。分别构建Beclin-1-siRNA特异性敲低肝细胞Beclin-1及non-specific-siRNA(NS-siRNA)转染细胞株。研究对象分成六组:CON组:等体积PBS处理肝细胞;STF组:10mM STF-083010溶解于PBS处理肝细胞;TAA组:70μM TAA溶解于PBS处理肝细胞。TAA+STF组:70μM TAA+10mM STF-083010溶解于PBS处理肝细胞;TAA+STF+NS-siRNA组:70μM TAA+10mM STF-083010溶解于PBS处理NS-siRNA转染肝细胞;TAA+STF+Beclin-1-siRNA组:70μM TAA+10mM STF-083010溶解于PBS处理Beclin-1-siRNA转染肝细胞。常规培养6小时,收集细胞上清,Western blot测定各组p-IRE1α,sXBP1,LC3B,p62,Beclin-1表达情况。采用DCFDA ROS检测试剂盒测定肝细胞ROS水平。乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定肝细胞毒性,CCK-8法测定肝细胞活力。结果1.TAA诱导的小鼠肝损伤在24小时内逐渐加重。TTA组与CON组相比较,血清学检测AST、ALT水平逐渐升高,HE染色提示肝组织损伤加重,坏死区域增多。Western blot检测显示随着时间延长,p-IRE1α,sXBP1表达逐渐上调,而IRE1α蛋白表达无变化。并且,以上变化在24小时节点达到高峰。2.生存实验显示,单独致死剂量TAA处理组小鼠在48小时内均死亡(100%)。低剂量STF-083010(30mg/kg)组小鼠死亡率与TAA组相似。然而,更高剂量的STF-083010(50mg/kg)显著降低了TAA诱导的死亡率(67%),差异存在统计学意义。提示STF-083010显著降低了TAA诱导的死亡率。但是,进一步增加STF-083010至70mg/kg,小鼠死亡率未获得改善。因此,确定STF-083010的有效浓度为50mg/kg。在肝损伤实验中,STF+TAA组与TAA组相比较,AST、ALT水平显著下降,HE染色显示肝脏坏死区域减少,TUNEL法观察到肝细胞凋亡明显减少,差异存在统计学意义。DHE染色法测定显示TAA组较CON组活性氧产物明显增多,qRT-PCR结果显示TAA组较CON组促炎细胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β等表达上调。而,给予STF预处理(即TAA+STF组)肝脏活性氧产物及炎症因子表达均出现明显减少。3.Western blot结果提示,STF+TAA组与TAA相比较,sXBP1表达明显降低,而自噬标志分子LC3B表达升高、p62表达降低,自噬启动子Beclin-1表达显著升高,差异存在统计学意义。结果提示STF+TAA双干预时,可能通过上调激活Beclin-1启动自噬。进一步使用自噬抑制剂CQ体内封闭自噬后,STF+TAA+CQ组与STF+TAA组相比,AST、ALT水平显著升高,HE染色显示肝脏坏死区域增加,TUNEL法观察到肝细胞凋亡明显增多,DHE染色法测定显示活性氧产物明显增多,qRT-PCR结果显示促炎细胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β等表达上调。差异存在统计学意义。4.体外实验结果显示,STF-083010显著提高了TAA IC50水平(TAA组IC50=47.32μM vs TAA+STF组IC50=62.19μM)。TAA组与CON组比较,p-IRE1α,sXBP1蛋白表达上调,差异存在统计学意义。STF+TAA组与TAA组比较,sXBP1表达下调,Beclin-1表达上调,自噬标记分子LC3B表达上调,P62表达下调。肝细胞ROS水平下降。肝细胞产生的LDH减少,肝细胞活力增加。差异存在统计学意义。使用siRNA技术特异性敲低Beclin-1结果显示,TAA+STF+Beclin-1-siRNA组与TAA+STF+NS-siRNA组相比:肝细胞ROS水平升高。肝细胞产生的LDH增加,肝细胞活力下降。差异存在统计学意义。结论1.IRE1α-sXBP1信号参与TAA诱导的小鼠肝损伤,其信号强度与肝损伤的严重程度相关2.STF-083010可以通过阻断IRE1α-XBP1信号通路,上调Beclin-1表达,激活Beclin-1依赖的自噬,从而改善TAA引起的小鼠肝脏损伤、氧化应激及炎症反应。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575
【图文】：

腹腔注射,小鼠,急性肝损伤,血清

n=6）给予腹腔注射 200mg/Kg 中毒剂量 TAA。分别于 TAA 处理收集血清。检测血清 ALT 水平。sXBP1 信号参与 TAA 诱导急性肝损伤的发展们评估了 TAA 诱导的急性肝损伤的时间进程。如图 2A-TAA 诱导的肝损伤在 24 小时内逐渐加重，表现为 ALT/ 伤加重，坏死区域增多。Western blotting 检测 IRE1α蛋白质含量(图 2D)。我们发现随着 TAA 诱导时间延长，白质表达量逐渐升高（p< 0.05）。而 IRE1α表达无变RE1α-sXBP1 信号参与 TAA-诱导的急性肝损伤的发展。

信号通路,死亡率,小鼠

图 2：TAA 诱导小鼠肝脏中 IRE1α-sXBP1 信号通路被激活。小鼠（n=6）给予腹腔注射200mg/Kg 中毒剂量 TAA .分别于 TAA 处理后 6h、12h、24h 收集肝脏组织及血清。(A, B) 血清 ALT、AST 水平； (C) HE 染色代表性图像(×100), 评估肝脏坏死情况；(D) Western blot分析肝脏组织中 IRE1α, p-IRE1α及 sXBP1 蛋白表达水平。β-actin 设置为内参。数据以均数±标准差表示。*p< 0.05, 与 CON 组比较。3.STF-083010 可减轻 TAA 诱导的急性肝损伤3.1.使用一种特定的 IRE1α核糖核酸酶抑制剂：STF-083010,抑制体内 IRE1α-sXBP1 信号。我们发现 STF-083010 显著降低了 TAA 诱导的死亡率。如图 3A所示，单独致死剂量 TAA 处理组小鼠在 48 小时内均死亡（100%）。低剂量STF-083010 (30mg/kg)组小鼠死亡率与 TAA 组相似。然而，更高剂量的STF-083010 (50mg/kg)显著降低了 TAA 诱导的死亡率(67%),差异存在统计学意义（p<0.05）。提示 STF-083010 显著降低了 TAA 诱导的死亡率。但是，进一步增加 STF-083010 至 70mg/kg，小鼠死亡率未获得改善。因此，确定 STF-083010

节点,肝坏死,急性肝损伤,肝损伤

南京医科大学博士学位论文3.2.根据前期实验结果，我们发现 TAA 诱导的小鼠肝损伤在 24 小时节点最严重，达到峰值。因此，后期所有观察节点选择为 24 小时节点。如图 3B-D 所示，与 TAA 组相比，STF-083010 明显减轻了 TAA 诱导的肝损伤。表现为：TAA+STF组血清 ALT/AST 水平降低，HE 染色见肝坏死面积减少（p< 0.05）。我们也通过TUNEL 染色来评估肝细胞的凋亡。结果表明，STF-083010 对 TAA+STF 组小鼠肝细胞凋亡具有明显的抑制作用，表现为 TUNEL 阳性细胞较 TAA 组减少（图 3E）（p< 0.05）。以上结果表明，STF-083010 可以减轻 TAA 诱导的急性肝损伤。

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