脱硫弧菌与肝纤维化的相关性研究

发布时间：2020-07-24 14:04

【摘要】：肝纤维化是包括肝硬化、病毒性肝病、酒精性肝病等慢性肝病发展过程中所共有的阶段,肠道微生物及其代谢物与肝纤维化进程有一定相关性。脱硫弧菌是硫酸盐还原菌在生物体内的重要成员之一,与肠道炎症等疾病密切相关。短链脂肪酸是肠道微生物的重要代谢产物,具有许多生理作用。本论文研究了脱硫弧菌对正常小鼠、CCl_4诱导肝纤维化小鼠的肝纤维化发展及其肠道短链脂肪酸合成的影响,主要工作如下:(1)建立了UPLC测量粪便样品中短链脂肪酸含量的方法。首先对肠道中可能存在的短链脂肪酸种类进行调研,对11种报道过的短链脂肪酸进行了全波长扫描,流动相优化,柱温优化,流速及洗脱程序优化和内标选择。并对所建方法的线性、保留时间、检测限、定量限、回归方程、准确度及精密度等指标进行了方法学验证。将所建立方法与常用气相色谱法进行对比,结果显示此方法能在10分钟内快速分离11种短链脂肪酸,其加标回收率为98.15-106.07%,精密度为0.58-7.33%,并有良好的线性,可用于粪便中短链脂肪酸的检测。新建立的UPLC法单次分析时间短,可检测短链脂肪酸数量多,更适合于粪便样品的检测。(2)肝纤维化模型动物肠道中脱硫弧菌的差异性分析。通过对CCl_4诱导的肝纤维化小鼠粪便脱硫弧菌含量检测发现,造模10周的小鼠与未造模小鼠脱硫弧菌含量相比增高近19倍(p0.01),提示脱硫弧菌在肠道中过量增殖与肝纤维化存在一定相关性。(3)将脱硫弧菌标准菌液(NC+ATCC 29577组)及富集菌液(NC+Df-enrichment组)灌胃正常小鼠,通过qRT-PCR法确认了外源脱硫弧菌可引起正常小鼠体内脱硫弧菌的增加(~(***)p0.001)。对小鼠肝指数、组织切片天狼猩红染色等表观指标评价表明,与对照组(NC+PBS组)相比,NC+ATCC 29577组及NC+Df-enrichment组肝指数分别增高26.3%及30.5%(~*p0.05),实验组小鼠肝组织血管附近均出现显著的胶原蛋白沉积,胶原蛋白前体物质羟脯氨酸分别升高了64.7%及49.4%(~(**)p0.01)。血清谷草转氨酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)测定结果表明,实验组小鼠肝组织损伤均显著性增加(p0.05)。两实验组小鼠α-SMA基因表达分别增高270.4%及303%(~(***)p0.001),Col1基因表达分别增高近17倍及23倍(~(**)p0.01,~(***)p0.001)。上述结果表明正常小鼠在灌胃外源脱硫弧菌一段时间后,均出现了肝纤维化。对CCl_4诱导的肝纤维化小鼠灌胃标准菌液(CCl_4+ATCC 29577)及富集菌液(CCl_4+Df-enrichment),仅CCl_4+ATCC29577组小鼠肠道脱硫弧菌含量较模型组(CCl_4+PBS)增加28.87%(p0.05)。两组小鼠肝指数、肝脏羟脯氨酸、肝纤维化相关基因α-SMA及Col1与CCl_4+PBS组相比无明显差异。与CCl_4+PBS组相比,CCl_4+ATCC 29577组ALT、AST显著性增加(p0.05),而CCl_4+Df-enrichment组AST水平也有显著性增高(p0.05)。采用灭活菌液探究小鼠脱硫弧菌含量,结果显示灭活菌液并无法引起正常小鼠粪便脱硫弧菌含量的增加(p0.05),其肝指数、肝脏羟脯氨酸含量等检测结果也表明该组小鼠没出现肝纤维化现象。(4)CCl_4+ATCC 29577及CCl_4+Df-enrichment小鼠肝组织中硫化氢含量较NC+PBS组出现显著性下降(~(***)p0.001),而在血清中硫化氢含量较NC+PBS组相比增加26.2%及21.2%(~(**)p0.01,~(***)p0.001)。肝脏硫化氢合成相关基因表达结果表明灌胃脱硫弧菌可上调CSE表达并下调CBS基因表达,趋势与CCl_4造模后相同,表明脱硫弧菌可能是通过影响机体中硫化氢代谢进而影响肝脏纤维化,而粪便中硫化氢含量与血清出现相同的升高。对粪便样品SCFAs含量进行分析,CCl_4+ATCC 29577及CCl_4+Df-enrichment组的乙酸含量较CCl_4+PBS提升近16%(~#p0.05),表明脱硫弧菌对乙酸代谢相关菌群影响较大。此外CCl_4+Df-enrichment组在丁酸及戊酸含量较CCl_4+PBS组亦有显著性增加(~#p0.05),表明脱硫弧菌富集菌液对丁酸及戊酸相关代谢菌群有一定关联。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575
【图文】：

第一章 绪论SRB 可通过氧化还原作用利用硫酸盐产生 H2S 进入血液中发挥其生理作用。肝脏是硫化氢合成的重要部位之一，合成途径如图 1-1 所示。H2S 是生物体内重要的气体分子，已被证明与心血管系统的功能调节有密切的关联，它可舒张血管平滑肌，降低血压，有效保护心血管[46]。然而，当体内 H2S 浓度累积到一定浓度时，可能抑制丁酸盐氧化，引发细胞凋亡[47]。小鼠体内的硫化氢代谢主要通过 SRB 将肠道中血红素类化合物转化为

江南大学硕士论文SCFAs 在肠道中的浓度并不完全相同，以盲肠与近结肠段最高[54]。膳食纤维在内的微生物转化结果合成了三种主要的 SCFAs：醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐。乙酸盐丙酮酸通过乙酰 Co-A 生成的，也可以通过 Wood-Ljungdahl 通路产生。丁酸是由两子的乙酰辅酶 a 合成的，产生乙酰乙酰 Co-A，通过 β-羟基丁基 Co-A 和巴豆酰基 C进一步转化为丁基 Co-A。丙酸盐可由 PEP 通过琥珀酸途径或丙烯酸酯途径形成，乳被还原为丙酸酯。微生物也可以通过丙二醇途径从脱氧己糖（如海藻糖和鼠李糖）生丙酸[56]。

20流动相对短链脂肪酸分离色谱图（a）10 mM H2SO4（b）乙腈-NaH2PO-NaH2PO4hromatograms of different mobile phase for analysis of SFCAs (a) 10 mM HAcetonitrile- NaH2PO4(c) Methanol- NaH2PO4注：1.甲酸，2.乙酸，3.丙酸，4.丁酸确定结果标物质的保留时间及与各分析物分析效果分析，草酸、柠檬酸min 内，与待测的甲酸、乙酸分离效果较差，通过改变流速及分离效果。而 2-乙基丁酸出峰时间介于正戊酸及 3-甲基戊酸之的分离效果，适合用于内标物质。各内标物保留时间随流速变

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