核自噬参与肝细胞脂变的相关性研究

发布时间：2020-07-25 07:32

【摘要】：目的:探讨核自噬与肝细胞脂变的相关性,从核自噬的新角度阐明肝细胞脂变的发病新机理,以期为非酒精性脂肪性肝病的发病机制及防治提供新的切入靶点。方法:1.体外培养人正常肝细胞WRL68细胞,应用不同浓度的游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)(油酸:棕榈酸=2:1)诱导WRL68细胞脂肪变,选出最佳诱导浓度及时间,建立脂肪肝细胞模型;2.将WRL68细胞分为两组,分别为正常对照组(Control)及FFA诱导肝细胞脂变组;分别于不同时间段用自动生化仪检测甘油三脂及胆固醇的含量,结合油红“O”染色结果,以评估肝细胞脂质沉积程度;3.电子透射镜观察各组肝细胞中核自噬现象;4.应用Western blot技术在不同时间段分别检测胞质中及胞核中LC3、LaminB1蛋白的表达。结果:1、肝细胞脂质沉积结果显示:用不同浓度FFA(0mmol/l、0.25mmol/l、0.5mmol/l)分别处理WRL68细胞6h、24h及48h,诱导肝细胞脂肪变。成功建立肝细胞脂变模型,结合油红染色结果及细胞内TG、TC值,FFA诱导浓度以0.5mM为最佳,且诱导后24h为观察表型现象最佳时间。2、透射电镜下可见:无法很清晰地看到核内的自噬情况。但在胞质中,培养1h观察,与对照组相比,0.5mM FFA处理组出现少量囊状小泡,部分小泡内可见细胞器。在处理24h后,FFA处理组细胞质内含细胞器的囊状小泡基本不可见。3、Western blot检测WRL68细胞中LC3、LaminB1的表达结果显示:在胞核中,经FFA诱导后,LaminB1表达量较control组明显升高,而LC3II表达量较control组比呈下降趋势。在胞质中,LaminB1几乎不表达;在培养6-24h后,FFA诱导组较control组LC3II表达量呈增加趋势,而LC3II/I的值明显呈下降趋势;在培养48h后,FFA诱导组LC3II蛋白的表达量control组降低,但LC3II/I值升高。结论:核自噬受抑参与肝细胞脂变过程,可能成为干预肝细胞脂变的新靶点。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.5
【图文】：

质变,浓度,情况,红色

第 3 章实验结果第 3 章实验结果3.1 FFA 处理细胞后油红染色检测脂质变化情况分别用不同浓度的 FFA（0mmol/l、0.25mmol/l、0.5mmol/l）诱导 WR胞脂肪变，浓度为 0.25mMFFA 处理 24h 后，WRL68 细胞内可见许多红色脂浓度为 0.5mMFFA 处理 24h 后，WRL68 细胞可见大量红色脂粒；用不同浓度处理 48h 后，趋势一致。（见图 1）结果表明：以 0.5mM FFA 诱导为最佳诱导浓度，24h 为观察表型现象所佳时间。0mM 0.25mM 0.5mM

直方图,相对变化,直方图,统计学意义

检测 FFA 诱导组肝细胞 TG 及 TC 含量，与 control 组相比较，TG 及 TC 含量明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；且随着时间的增加，即诱导 24h 后较control 组相比，TG 及 TC 含量明显升高更加明显，差异具有统计学意义（P<0.01）。实验结果表明，经 FFA 诱导后，随着时间的增加，肝细胞内脂质沉积进一步加重。（见表 1、图 2）表 1 不同处理组 TG 及 TC 值的变化(mmol/l)（ x±s，n＝3）分组 TG TCcontrol 0.0167±0.0058 0.0367±0.00586h FFA 0.0367±0.0058* 0.0630±0.0058*24h FFA 0.0867±0.0058# 0.1300±0.0100#注：与 control 组相比，*p<0.05；与 control 组相比，#p<0.01。

自噬,电子透射,自噬体

图 3.电子透射镜下观察核自噬（X5000-20000）：第一列图片（X5000）；第二列图片（X10000）；第三列图片（X20000）WB 检测 LC3B、LaminB1 蛋白表达情况噬相关基因 LC3 定位于细胞质和细胞核，核和核膜相关的 LC3 蛋白似乎C3-II 形式存在[21]。而当自噬形成时，胞浆型 LC3（即 LC3-I）会酶解多肽，转变为（自噬体）膜型（即 LC3-II），因此，LC3-II/I 比值的大自噬水平的高低[23]。且 LC3-Ⅱ水平与自噬体数量密切相关，是自噬体好标志[24]。而 LaminB1 可以与 LC3 相互作用，因此，LC3-II 及 Lamin达量可估计核自噬水平的高低。在上面的电镜下在细胞核中未观察到自小体的形成，为了检测核自噬的情况，我们通过分别检测细胞质及细胞中 LC3B、LaminB1 的水平来评估核自噬的情况。同时因 LC3B 抗体对II 又更高的亲和力，通常 LC3B I 的减少并不与 LC3B II/I 的增加同步，

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