肝细胞膜受体GRP78的真原核表达及功能研究

发布时间：2020-07-27 18:49

【摘要】： 葡萄糖调节蛋白前体78(GRP78)最早是从细胞内质网中被发现的。内质网中的GRP78主要的生物学功能是参与钙平衡的调节,新生蛋白在内质网的跨膜迁移以及蛋白质的折叠,成熟,转运及逆转运等。除了细胞内质网外,细胞的膜上也有GRP78表达。有研究者提出细胞膜上的GRP78可以作为受体分子和信号转导分子而存在。而随后的研究也证实了这一观点:GRP78是2型登革热病毒在肝细胞膜上的受体复合物的成分之一,也是A9型科萨奇病毒的共受体分子之一,细胞表面的GRP78分子在信号的转导和抗原的呈递等方面都有作用。 乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)的感染是威胁人类生命健康的全球性的公共卫生问题之一。我们对HBV基因的组成、复制、抗原的结构及生物学特性等方面已经有比较深入的了解,但是由于缺乏合适的体外感染的模型使我们对HBV早期的感染过程,如HBV的黏附、脱壳等过程都没有深入的了解。目前绝大多数的研究都认为HBV主要可能是通过病毒表面的大蛋白(large surface HBV antigen,LHBs)preS1特异性地与人肝细胞膜上的特异受体发生识别和黏附,从而介导病毒进入细胞内,启动病毒的复制周期。本课题组在前期研究中以重组的融合蛋白GST-preS1为探针蛋白,采用pull down的技术直接分离出能够与preS1结合的HepG2细胞膜蛋白成分,并进一步通过质谱分析,鉴定出该蛋白为GRP78。 本课题首先利用了荧光抗体标记的技术,通过激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)观察到了GRP78在HepG2的细胞膜、细胞浆中均有表达,在细胞膜上呈均匀的分布,证实了GRP78是HepG2细胞的膜成分之一。我们利用了RT-PCR方法直接从HepG2细胞中扩增出GRP78的cDNA序列,利用了基因重组技术将GRP78及其分段表达的GRP78N, GRP78C与His标签在原核系统中进行融合表达,成功的构建了原核表达质粒PW28-GRP78,PW28-GRP78 N和PW28-GRP78C ,并成功的诱导了重组蛋白His-GRP78、His-GRP78N、His-GRP78C的原核表达及纯化。利用实验室原有的原核表达系统表达的GST-preS1重组的融合蛋白为配体蛋白,采用pull down技术和间接ELISA的方法检测GRP78与其分段表达的融合蛋白与preS1的体外结合试验。结果显示preS1可以与GRP78特异性地结合,特别是与GRP78的N段,与His标签无关,且与HBV呈剂量依赖性。在此基础上,我们成功构建了pcDNA3.1-GRP78真核表达载体,并通过Western blot和激光共聚焦显微镜都观察到了GRP78在HEK293细胞中成功地表达。 本课题的研究结果提示了GRP78可能作为HBV感染肝细胞的早期过程中起关键作用的候选分子之一。我们的研究为进一步地研究HBV入侵人肝细胞的作用机制奠定了基础。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R512.62
【图文】：

4）去封闭液，加入按 1：100 比例稀释的兔抗 GRP78 的一抗，在 4 ℃条件下过孵育；5）去一抗溶液，用 PBS 充分地漂洗玻片，后加入按 1：400 的比例稀释的 FIT标记的二抗，在室温条件下避光孵育 2 小时；6）去二抗溶液，在避光环境下 PBS 充分漂洗爬片细胞；7）用水溶性封片剂甘油进行封片，在 LSCM 下观察 GRP78 在细胞中的分布情2 实验结果2.1 GRP78 在 HepG2 细胞上的分布将 HepG2 细胞进行细胞爬片后以抗 GRP78 为一抗进行标记，用 FITC 标记二抗进行追踪标记，在激光共聚焦显微镜下观察 GRP78 在 HepG2 细胞中的分布况。如图 1.1 所示：GRP78 在 HepG2 细胞的细胞膜和细胞浆中均有表达，GRP在细胞膜上呈均匀的分布。

图 2.2 1%琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物图 2.3 重组质粒酶切鉴定Fig 2.2 Analysis of PCR products by 1%agarose gel electrophoresisFig 2.3 Identification of recombinant plasmids byenzyme digestionM: DL2000 DNA MarkerLane1: GRP78 PCR productLane2: GRP78N PCR productLane3: GRP78C PCR productLane1,3,5,7,9,11: recombinant plasmid; Lane2,4：digestedrecombinant plasmid PW28-GRP78Lane6,8: digested recombinant plasmid PW28-GRP78N;Lane10,12: digested recombinant plasmid PW28-GRP78C2.3 重组融合蛋白 His-GRP78、His-GRP78N、His-GRP78C 的表达和纯化将重组表达质粒 PW28-GRP78,PW28-GRP78N,PW28-GRP78C 转化入大肠杆菌 BL21 后，融合蛋白在 IPTG 的诱导下有表达。菌体裂解液上清的 PAGE 电泳的

图 2.2 1%琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物图 2.3 重组质粒酶切鉴定Fig 2.2 Analysis of PCR products by 1%agarose gel electrophoresisFig 2.3 Identification of recombinant plasmids byenzyme digestionM: DL2000 DNA MarkerLane1: GRP78 PCR productLane2: GRP78N PCR productLane3: GRP78C PCR productLane1,3,5,7,9,11: recombinant plasmid; Lane2,4：digestedrecombinant plasmid PW28-GRP78Lane6,8: digested recombinant plasmid PW28-GRP78N;Lane10,12: digested recombinant plasmid PW28-GRP78C2.3 重组融合蛋白 His-GRP78、His-GRP78N、His-GRP78C 的表达和纯化将重组表达质粒 PW28-GRP78,PW28-GRP78N,PW28-GRP78C 转化入大肠杆菌 BL21 后，融合蛋白在 IPTG 的诱导下有表达。菌体裂解液上清的 PAGE 电泳的

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本文编号：2772227