去脾脏功能大鼠通过调节PTEN的表达影响肝纤维化

发布时间：2017-03-30 15:03

  本文关键词：去脾脏功能大鼠通过调节PTEN的表达影响肝纤维化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[背景] 肝纤维化是各种损伤因子累及肝脏后的一种病理状态,几乎任何能造成肝脏损害的因素均可致肝脏发生纤维化。如慢性乙型肝炎,慢性丙型肝炎,脂肪性肝炎,自身免疫性肝病,血吸虫肝病,药物性肝病和一些先天代谢性疾病等均,可引起肝纤维化。在此病理进程中正常功能的肝细胞数量减少肝小叶结构改变血液循环紊乱致肝脏功能逐渐丧失最终发展为肝硬化。随着医学科学的发展人们逐渐认识到肝纤维化是肝脏受损后机体在修复过程中纤维组织在肝组织中过度沉积的一种可逆性病理现象。部分研究证实肝纤维化甚至肝硬化患者经过治疗以后也会发生逆转因此肝纤维化机制的阐明有助于阻止或延缓纤维化的发展。 脾脏作为外周最大的淋巴器官,其免疫功能具有“双向性”,即脾脏免疫细胞的活化和炎症因子的释放在发挥抗感染作用的同时又会反过来对机体造成严重损伤,同时具有“时相性”的特点,即免疫功能在某一时间点免疫的正向保护作用发生反转,成为负向的免疫损伤作用。研究表明,一方面在肝纤维化发展过程中行脾脏切除有利于肝损伤修复的同时也能够延缓肝纤维化的发展,并改善患者肝功能；另一方面,临床回顾性研究发现肝硬化合并肝癌患者行肝癌切除联合脾脏切除的患者术后无瘤生存率明显优于单纯行肝癌切除的肝硬化患者。因此,脾脏可通过某种细胞因子或者信号通路影响肝脏组织的自我修复并影响患者愈后。 PTEN基因,是第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因,是于1997年发现的一种肿瘤抑制基因。它同时具有蛋白磷酸酶活性和脂质磷酸酶活性。随着肿瘤细胞分子遗传学的研究不断深入,揭示出多种肿瘤的发生与PTEN基因表达的缺失或突变存在联系,比如：恶性胶质瘤、前列腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、小细胞肺癌、乳腺癌等。同时,在许多非肿瘤性疾病中也发现了PTEN基因表达的异常,如肺纤维化,支气管哮喘、内风湿性关节炎等。研究发现,PTEN表达随着肝纤维化进展而下降,且在体外环境中PTEN基因表达与HSC(肝星状细胞)的活化及增殖能力成负相关,然而HSC的活化是肝纤维化的中心事件,在细胞因子、炎症介质、乙醛、氧自由基等的刺激下HSC转变为表达α-SMA (α平滑肌肌动蛋白)的肌成纤维样细胞,并在肝损伤部位移行、增殖,产生大量胶原纤维。同时,α-SMA是活化HSC的标志,肝组织中α-SMA的表达可反映HSC活化、增殖的程度。因此,PTEN基因的表达与肝纤维化密切相关。 综上所述,去脾脏功能延缓肝纤维化的发展与肝纤维化过程中PTEN基因表达下降是否存在某种联系,有待进一步探讨,本研究通过脾脏切除的方式探讨脾脏在肝纤维化发展过程中对PTEN表达的影响及延缓肝纤维化的可能作用机制。 [目的] 探讨去脾脏功能对PTEN在大鼠纤维化肝组织中表达的影响及延缓肝纤维化的相关作用机制。 [方法] 1.1实验分组健康雄性SD大鼠135只,清洁级,体重250±20g,由南方医科大学实验动物中心提供(医动字第4402101312号)。全部动物均在同一实验室按清洁级大鼠要求由专人饲养,自由进食水。将135只大鼠随机分成实验组：胆总管结扎+脾脏切除组(A组,45只)、胆总管结扎+脾脏假手术组(B组,45只)；对照组：假手术组(C组,45只)。A、B、C组分别于结扎后1周、3周、5周随机抽取10只,乙醚吸入麻醉。无菌条件下切开皮肤进入腹腔,留取左叶肝组织150mg以备提取蛋白及核酸；另外切取部分肝脏左叶,以4%多聚甲醛固定,用于HE染色、天狼星红染色及免疫组织化学法染色。实验过程中共死亡27只(其中A组12只,B组14只,C组1只),余18只采用断颈法处死。 1.2去脾脏功能肝纤维化模型的建立适应性喂养1周后,实验组于术前8h禁食水,乙醚麻醉后固定,术区备皮消毒,铺无菌单,乙醚吸入麻醉配合5%的利多卡因注射液局部浸润麻醉满意后,取左上腹部原手术切口,逐层切开腹壁进入腹腔。胆总管结扎十脾脏切除组(A组)：游离脾脏周围韧带,1号线双扎脾的全部血管,行脾切除术,如有副脾一并切除。游离胆总管后,3号线于近心端及远心端双重结扎胆总管并离断,以无菌棉签检查无胆漏及出血后逐层关腹。胆总管结扎+脾脏假手术组(B组)：游离脾脏周围韧带,保留脾脏,余同上。假手术组(C组)：术中游离部分大网膜,游离脾脏周围韧带,后逐层关腹。术后12h自由饮用20%葡萄糖,24h后自由进食。 1.3数据采集及分析采用HE染色及天狼星红染色法显示肝纤维化程度；应用Western blot和实时荧光定量PCR技术测定大鼠肝组织中PTEN mRNA、α-SMAmRNA的表达；应用Pearson's相关性分析分析二者间的相关性。 [结果] 1.大鼠肝纤维化病理学改变随着造模时间的延长,A、B两组大鼠肝脏组织可见不同程度的肝细胞变性坏死并逐渐出现肝纤维化。造模第5周末A、B、C组行HE染色可见,A、B两组均出现明显假小叶形成,且B组假小叶出现更多,更为明显,几乎看不到正常的肝脏组织结果,并伴有大量胆汁淤积,C组未出现肝纤维化。天狼星红染色,C组仅汇管区、中央静脉壁有少量胶原纤维。A、B组随着造模时间延长,胶原纤维逐渐增多,且同一时间点,B组肝脏组织分泌的α-SMA明显较A组多。 2.PTEN蛋白及α-SMA在肝纤维化组织中表达PTEN免疫组织化学染色结果显示,正常大鼠肝组织中PTEN蛋白有广泛表达,随着肝纤维化的进展,大鼠肝组织中PTEN阳性表达细胞明显减少,相同时间点B组较A组PTEN表达减少的更明显。α-SMA免疫组化结果显示,假手术组大鼠肝脏组织中仅少量的表达,主要表达于血管平滑肌。随着造模时间的延长,α-SMA在A、B两组表达逐步增加,同一时间点A组表达较B组少。 3.肝纤维化组织中PTEN mRNA及蛋白的表达水平造模1周、3周及5周不同时间大鼠纤维化肝组织的PTEN mRNA表达量为A组(1.48±0.21、0.72±0.12、0.57±0.14)均明显高于B组(0.79±0.21、0.56±0.14、0.33±0.11),两组间比较有显著性差异(p0.01)。相同时间点,A组与B组比较均有显著性差异(p0.05)。PTEN mRNA表达量与PTEN蛋白的表达是一致的,即A、B两组间PTEN蛋白表达量的比较均有显著性差异(p0.01)。α-SMA在正常大鼠肝组织中仅在血管壁平滑肌细胞有弱阳性表达；随着肝纤维化的发展,大鼠肝组织中α-SMA表达量逐步增多,造模1、3周及5周末大鼠肝脏组织中A、B两组间均有显著性差异(p0.01)。 4.PTEN蛋白表达量与α-SMA的相关性分析对PTEN蛋白表达量与α-SMA表达量进行Pearson's相关性分析,结果显示大鼠纤维化肝组织中PTEN表达量与α-SMA的表达呈显著负相关(r=-0.86,P0.05)。 [结论] 1.肝纤维化大鼠模型中,去脾脏功能可上调PTEN在肝纤维化组织中的表达,并减少α-SMA的分泌从而延缓肝硬化的发生。 2.胆总管结扎联合脾脏切除是一种行之有效的构建去脾脏功能肝纤维化模型的方法。
【关键词】：α-SMA 肝纤维化 PTEN 脾切除 TGF-β1
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-17
• 实验材料和方法17-29
• 1 材料17-20
• 2. 动物模型建立20-21
• 3. HE染色21-22
• 4. 天狼星红染色法22
• 5. 免疫组织化学染色(SP染色)22-23
• 6. 肝组织蛋白提取液的制备23-24
• 7. 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白含量24
• 8. 蛋白印迹法(Western blot)24-26
• 9. 实时荧光定量PCR(Real-time Q-PCR)26-28
• 10. 统计学处理28-29
• 结果29-36
• 1. 一般情况29-30
• 2. 病理组织学变化30-31
• 3. PTEN蛋白及α-SMA在肝纤维化组织中表达31-33
• 4. 肝纤维化组织中PTEN mRNA及蛋白的表达水平33-36
• 讨论36-39
• 参考文献39-45
• 综述45-56
• 参考文献51-56
• 主要中英文词缩略表56-57
• 发表论文一览表57-58
• 致谢58-59

【参考文献】

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本文编号：277388